论文部分内容阅读
心里美萝卜（Raphanus sativus.L）（别名水果萝卜）属十字花科一年生草本植物,是我国著名的药食同源蔬菜品种之一。心里美萝卜主要成分为花青素和多糖化合物,具有抗氧化、抗癌、抗炎抑菌、预防心血管疾病、增强免疫力和改善视力等生理活性。与传统单一提取技术存在提取不完全、效率低和溶剂用量大的缺点相比,新型提取技术如酶辅助提取法,超临界流体提取法,超声辅助提取法和微波辅助萃取法因具有提取高效的特点逐渐被应用。酶辅助提取法通过高效专一水解和破坏植物细胞壁组成从而释放细胞内容物,增强生物活性化合物的提取,常作为辅助技术应用。微波辅助萃取法是一种有前途的萃取方法,具有萃取效率高,溶剂消耗低且易于控制的优点,它是基于离子传导和偶极旋转对分子的直接作用。微波辐射引起溶剂温度和细胞内压力的迅速升高,从而加速目标化合物在植物基质中扩散并释放植物细胞内的生物活性化合物。为尽可能获取更多的产品,本文将酶辅助提取法与微波辅助提取法相结合,旨在协同发挥两者优势,建立高效提取心里美萝卜中有效成分的新技术,既克服常规提取技术的缺点,又能促进提取产率的提高。鉴于花青素和多糖化合物强大的生理活性,采用光谱分析和色谱分析分别心里美萝卜中花青素稳定性、单体结构以及多糖组成和抗氧化活性,为医药、食品等产品开发提供基础,具体研究内容如下:1、采用酶解催化和微波辅助提取方法,将两种方法进行有机结合联用萃取心里美萝卜中的花青素,旨在协同发挥两者的优势,提高提取效率。为此研究了酶种类、pH、温度、提取时间、液料比和颗粒度等因素对花青素提取率的影响,结合响应面设计方法进一步优化了提取条件。结果表明:选择24%纤维素酶浓度,pH=4.00,以60%乙醇为提取溶剂,提取温度50℃,时间7.17 min,液料比60 mg/L以及药材颗粒度80目时,可以达到较高的提取率。花青素提取率为6.125±0.034 mg/g,与模型预测值6.292 mg/g基本一致。除此之外,还测得心里美萝卜样品含水量为92.114±1.036%,灰分6.065±0.025%,蛋白质136±3 mg/g,黄酮化合物38.017±0.207 mg/g和多酚化合物29.417±1.084 mg/g。与传统的单一提取技术相比,本实验建立的新提取方法不仅可以协同发挥酶和微波的作用,而且克服了耗时和操作繁琐的缺点,可代替常规提取方法用于花青素的提取中。2、采用大孔树脂分离法,对提取的花青素提取物进行了分离纯化,以便进一步研究花青素的稳定性和抗氧化活性。通过筛选发现D101大孔树脂具有较好的分离性能。利用该树脂分别采用静态和动态试验方法对花青素提取物研究了纯化分离条件,以进一步提高纯度。结果表明:当样品溶液pH=2.00,最大上样体积520 mL（浓度0.15 mg/mL）,最大水洗体积600 mL,以80%乙醇（含0.1%HCl）为洗脱剂,最大洗脱剂体积150 mL,花青素纯度从0.794±0.026%提高到19.538±0.522%（色价从4.035±0.051提高到86.975±0.138）。纯化后产品通过稳定性试验发现pH、温度和光照明显地影响花青素的降解速度,大部分金属离子和食品添加剂对花青素无明显不良影响,但Fe3+、Vc和山梨酸钾的加入会使花青素发生沉淀或者降解;通过抗氧化活性试验,结果表明花青素对DPPH自由基,超氧阴离子,ABTS自由基和羟基自由基均具有较强的清除能力,分别为93.95±0.01%,87.40±0.14%,99.56±0.34%和77.85±1.68%,IC50分别为0.026 mg/mL,0.043 mg/mL,0.0080 mg/mL和0.046 mg/mL。3、采用高分辨高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱（HPLC-Q-Orbitrap-MS）技术对纯化后的花青素进行了鉴定。研究色谱分离结果、一级和二级碎片离子质谱图,经过综合分析推断,发现纯化后的花青素提取物中有11种花青素,其化学结构主要是以天竺葵色素为母体的酰基化花色苷。其中以天竺葵素-3-（对香豆酰）二葡萄糖苷-5-葡萄糖苷含量最高,以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为外标,采用高效液相色谱法测得该花青素含量为1.95 mg/g。4、通过酶筛选试验,利用木瓜蛋白酶进行酶解催化,与微波辅助双水相提取方法结合,以乙醇-硫酸铵双水相体系为萃取剂,研究了微波场强化和酶辅助提取心里美萝卜中多糖的各种因素的影响,建立酶-微波协同萃取多糖的新方法,旨在提高多糖的提取效率,并通过双水相提取获得不同的多糖。采用单因素试验和Box-Behnken Design设计优化提取过程,得到最佳提取条件如下:乙醇（w/w,26%）/硫酸铵（w/w,21%）双水相体系作为提取剂,木瓜蛋白酶浓度24.50%,pH为5.00,药材80目,提取温度68℃,提取时间为8.41 min,液料比63 mL/g,上相多糖（PTP）和下相多糖（PBP）的提取率分别为9.107±0.391%和32.506±0.046%。通过高效凝胶色谱法分析得到PTP和PBP的MW和Mn分别为15935 Da,4648 Da和27962 Da,8239Da。傅里叶-红外光谱分析表明PTP和PBP在3100 cm-1,2900 cm-1,1600 cm-1,1400 cm-1和1100-1000 cm-1处均有表征多糖结构的吸收峰。高效液相色谱法分析表明PTP由甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成,PBP由甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和少量岩藻糖组成;抗氧化活性研究表明PTP和PBP对超氧阴离子,DPPH,ABTS,羟基自由基清除率和抗脂质过氧化能力分别为39.12±1.89%,71.29±4.10%,57.89±0.16%,49.73±0.17%,56.67±2.21%和32.17±0.36%,40.80±1.11%,49.4 3±1.14%,39.51±1.60%,38.16±1.66%,说明心里美萝卜多糖具有开发成为抗氧化剂的潜力,扩宽新药研发的来源。