1研究背景和目的内毒素血症是临床上最为常见的一种全身炎症反应,创伤、感染、免疫机能下降、胃肠道粘膜缺血、甚至机械通气等都能导致内毒素血症的发生。而在外科手术的围术期,内毒素血症的发生更是尤为常见,如果不能及时很好地干预与处理,术后所导致的急性肾损伤、肺损伤、甚至多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunct ionsyndrome, MODS),常常是导致病人死亡的重要因素。因此在手术中如何能有效地降低以及抑制过度的炎症反应,以利于病人的术后康复,一直以来都是临床研究的一个热点问题。异丙酚(propofol),又名丙泊酚,是近年来发现的新型静脉麻醉药,化学名为2,6-双异丙基酚(2,6-di-isopropyl phenol),与巴比妥、丁香酚类、氯胺酮及甾体类等麻醉药物不同。它既可以作为麻醉诱导剂又可以作为静注全麻剂。异丙酚具有作用迅速、维持时间短,体内无蓄积、毒性小而有一定镇痛作用等优点已广泛用于临床和ICU镇静。近年来的研究发现,异丙酚可降低肺动脉压及抑制缺血性肺血管收缩反应,减轻右心负荷,同时还可抑制钙离子内流及释放,因此可望对缺氧器官具有保护作用。此外最受人们关注的就是异丙酚的抗炎,保护效应。从1992年O’Donnell等人报道临床剂量范围内的异丙酚在体外能够抑制中性粒细胞的极化(neutrophil polarization),并呈一定的剂量依赖性后,异丙酚与炎症反应的关系研究一直是异丙酚研究的一个重点方向。尽管目前对异丙酚抑制炎症反应的功能具有比较统一的认识,然而对于这一功能的具体分子机制目前并不清楚,更不可能形成一套完整的理论基础来指导临床实践,这也大大限制了异丙酚在炎症反应这一领域的具体应用。近来研究表明异丙酚可以通过抑制信号转导过程中的多种不同分子来抑制炎症反应,异丙酚可以增强TLR-4蛋白的下调,抑制CD14基因的表达及IκB的磷酸化,减少NF-κB向细胞核内的转移,进而减少血浆和组织中的细胞因子如IL-1、TNF-α、IL-8等。异丙酚还可通过抑制参与炎症反应的相关粘附分子和降低微血管内皮细胞的损伤,起到保护组织细胞的功能。Corcoran, T.B等证明异丙酚可抑制由于氧化损伤引起的脐静脉内皮细胞上血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)及细胞间粘附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)表达的增加,并首次通过体外实验证明异丙酚可抑制P-选择素在内皮细胞上的表达,阻碍白细胞与内皮细胞的粘附,并认为异丙酚对P-选择素的抑制作用,在心肌再灌注手术如心脏移植及冠脉搭桥手术中对心肌起到保护作用。研究发现内毒素血症中,异丙酚能够抑制丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase, MAPK)的激活、炎症因子的释放、NO的生成以及细胞骨架通透性的改变。但对于异丙酚如何抑制MAPK的激活以及炎症因子的释放的具体分子作用机制并不清楚。为了进一步研究异丙酚在内毒素血中抗炎的具体分子作用机制,我们前期构建了内毒素血症大鼠模型,采用蛋白质组学的方法分析异丙酚对大鼠血清和单个核细胞蛋白表达谱的影响。通过对正常对照组大鼠、内毒素血症组大鼠以及内毒素血症联合异丙酚处理组大鼠单个核细胞蛋白表达谱改变的深入研究,发现异丙酚能够促进单个核细胞中Annexin A1的表达。但现在的问题是：(1)异丙酚对p38磷酸化的抑制是否就是因为AnnexinA1的表达增高所直接引起?(2)如果异丙酚直接是通过Annexin A1而抑制了p38的磷酸化,那么IL-1、IL-6和TNF-α等炎症因子的释放在这一模型中是否就是直接受p38磷酸化的调控?(3)除了p38以外,在这一炎症模型中异丙酚对MAPK炎症信号通路中的ERK、JNK信号通路是否也有一定影响,这种影响是否也是与Annexin A1有关?2方法2.1第一部分：2.1.1异丙酚对内毒素血症大鼠血清单核细胞中Annexin A1和p38表达的影响实验随机分为6组：正常对照组(C组)、内毒素血症模型组(L组)、异丙酚组(P组)、LPS刺激+异丙酚处理组(L+P组)、脂肪乳组(1组)和LPS刺激+脂肪乳处理组(L+Ⅰ组),每组6只大鼠。处理6h后取各组大鼠血清,分离单核细胞,裂解细胞提取蛋白,western blot检测每组Annexin A1和p-p38的表达情况。2.1.2异丙酚对内毒素血症大鼠炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的释放情况：实验随机分为6组：正常对照组(C组)、内毒素血症模型组(L组)、异丙酚组(P组)、LPS刺激+异丙酚处理组(L+P组)、脂肪乳组(Ⅰ组)和LPS刺激+脂肪乳处理组(L+Ⅰ组),每组6只大鼠。处理6h后取各组大鼠血清,采用ELASA法分别检测TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度。2.2第二部分：2.2.1不同异丙酚浓度对Annexin A1表达的影响实验分为六组：C组：正常对照组；L组：LPS10μg/ml刺激6h组；L+P(5)组：LPS10μg/ml加异丙酚5μg/ml刺激6h组;L+P(10)组：LPS10μg/ml加异丙酚1010μg/ml刺激6h组；L+P(20)组：LPS10μg/ml加异丙酚2010μg/ml刺激6h组；L+P(30)组：LPS10μg/ml加异丙酚30μg/ml刺激6h组；L+P(50)组：LPS10μg/ml加异丙酚50μg/ml刺激6h组。刺激6h后收集细胞,裂解细胞提取蛋白,western blot检测Annexin A1的表达情况。2.2.2异丙酚对LPS刺激THP-1下Annexin A1表达的时间效应实验分为四组：C组：正常对照组;L组：LPS10μg/ml刺激组；L+P组：LPS10μg/ml加异丙酚20μg/ml刺激组； P组：异丙酚20μg/ml刺激组。分别刺激1h、2h、6h后收集细胞。Western blot检测Annexin A1蛋白表达。2.2.3异丙酚对LPS刺激THP-1下MAPK家族激活的时间效应实验分为四组：C组：正常对照组；L组：LPS10μg/ml刺激组；L+P组：LPS10μg/ml加异丙酚20μg/ml刺激组； P组：异丙酚20μg/ml刺激组。分别刺激0.5h、1h、2h、6h后收集细胞。Western blot检测p-p38、p-ERK1/2、p-JNK1/2蛋白表达。2.2.4异丙酚对LPS刺激THP-1下炎症因子的释放情况实验分为四组：C组：正常对照组;L组：LPS10μg/ml刺激组；L+P组：LPS10μg/ml加异丙酚20gg/ml刺激组； P组：异丙酚20μg/ml刺激组。采用ELASA法分别检测各组细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6的浓度。2.2.5脂肪乳对LPS刺激THP-1下Annexin A1和p-p38表达的影响实验分为六组：C组：正常对照组：L组：LPS10μg/ml刺激6h组；L+I组：LPS10μg/ml加脂肪乳20μg/ml刺激6h组； I组：脂肪乳20μg/ml刺激6h组。收集细胞,Western blot检测Annexin A1和p-p38蛋白表达。2.2.6siRNA-Annexin A1瞬时转染THP-1细胞采用电穿孔的方法将已合成的siRNA-Annexin A1转染至THP-1细胞中。2.2.7siRNA-Annexin A1转染效率及干扰效率的检测采用荧光显微镜观察转染效率；RT-PCR法检测Annexin A1表达情况确认干扰效率2.2.8Anneinx A1沉默后异丙酚对p-p38表达的影响实验分为四组： L组：LPS10μg/ml刺激6h组；L+P组：LPS10μg/ml加异丙酚20μg/ml刺激6h组；P组：异丙酚20μg/ml刺激6h组；L’组：转染siRNA-Annexin A1后给予LPS10μg/ml刺激6h组；L’+P’组：转染siRNA-Annexin A1后给予LPS10μg/ml加异丙酚20gg/ml刺激6h组。收集细胞,Western blot检测Annexin A1和p-p38蛋白表达。2.2.9Anneinx A1沉默后异丙酚对炎症因子释放的影响实验分为四组：L组：LPS10μg/ml刺激6h组；L+P组：LPS10μg/ml加异丙酚20μg/ml刺激6h组；P组：异丙酚20μg/ml刺激6h组；L’组：转染siRNA-Annexin A1后给予LPS10μg/ml刺激6h组；L’+P’组：转染siRNA-Annexin A1后给予LPS10μg/ml加异丙酚20μg/ml刺激6h组。收集细胞,采用RT-PCR方法检测各组细胞中TNF-α、 IL-1β、IL-6mRNA的表达水平。3结果3.1第一部分：3.1.1异丙酚对内毒素血症大鼠血清单核细胞中Annexin A1和p38表达的影响结果显示：与L组相比,P组和L+P组Annexin A1的表达量明显增高(P<0.01),而I组和I+L组无差异；与C组相比,L组、L+P组和L+I组的p38磷酸化水平显著增加(P<0.01)；与L组相比,L+P组p38磷酸化水平明显降低(P<0.01),而L+I组无统计学差异。3.12异丙酚对内毒素血症大鼠炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的影响与C组相比,L组、L+P组和L+I组IL-1p、IL-6和TNF-α的含量均明显增高(P<0.01)；与P组相比,L+P组IL-1β、IL-6和TNF-a的含量均明显增高(P<0.01)；与I组相比,L+I组IL-1β、IL-6和TNF-a的含量均明显增高(P<0.01)；与L组相比,L+P组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-a的含量均显著降低(P<0.01),而L+I组无差异。3.2第二部分：3.2.1不同异丙酚浓度对Annexin A1表达的影响随着异丙酚浓度的增加,Annexin A1的表达依次增加,当异丙酚浓度为30μg/mll时,对Annexin A1的激活达到最大效应,当异丙酚浓度为50μg/ml时,Annexin A1的表达减少,异丙酚浓度为20μg/ml时,对Annexin A1的激活与30gg/ml比较无统计学差异(P>0.05)。3.2.2异丙酚对LPS刺激THP-1下Annexin A1表达的时间效应在异丙酚刺激1h和2h时,与L组相比,L+P组和P组Annexin A1表达均无差异；在刺激6h时,与L组相比,L+P组和P组Annexin A1表达明显增加(P<0.01)。3.2.3异丙酚对LPS刺激THP-1下MAPK家族的影响与C组相比,L组p38磷酸化水平显著增高(P<0.01),P组无明显变化；与L组相比,L+P组的p38磷酸化水平在0.5h处无显著变化,从1h开始降低,2h、6h显著降低(P<0.01),并呈现递减趋势。在0.5h和1h时,与C组相比,L组ERK1/2磷酸化水平明显增高(P<0.01),2h和6h时两组则无显著差异；仅在异丙酚刺激1h时,L+P组ERK1/2磷酸化水平显著低于L组(P<0.01)。与C组相比,L组JNK1/2磷酸化水平明显增高(P<0.01),与L组相比,L+P组JNK1/2磷酸化水平无明显差异。3.2.4异丙酚对LPS刺激THP-1下炎症因子释放的影响与C组相比,L组、L+P组IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明显增高(P<0.01)；与P组相比,L+P组IL-1β、IL-6和TNF-a的含量均明显增高(P<0.01)；与L组相比,L+P组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均显著降低(P<0.01)。3.2.5脂肪乳对LPS刺激THP-1下Annexin A1和p-p38表达的影响C组、L组、I组、L+I组对Annexin A1表达均无显著差异(P>0.05)；对于p-p38的表达,与C组相比,L组和L+I组p38磷酸化水平显著增加(P<0.01),I组无明显差异；与L组,L+I组p38磷酸化水平无显著差异(P>0.05)。3.2.6Annexin A1转染效率和干扰效率转染效率可高达60%左右；与对照组相比,转染了siRNA-Annexin A1的细胞中Annexin A1mRNA的表达明显降低(P<0.01),其干扰效率可达75%。3.2.7Anneinx A1沉默后异丙酚对p-p38表达的影响在野生型中,与L组相比,L+P组p38磷酸化水平显著下降(P<0.01),在Annexin A1-/-细胞中,L组与L+P组p38磷酸化水平表达无显著差异(P>0.05)。3.2.8Anneinx A1沉默后异丙酚对炎症因子释放的影响与L组相比,L+P组IL-1β、IL-6、TNF-α的释放明显减少(P<0.01)；与L’组相比,L’+P’组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放无显著差异(P>0.05)。4结论(1)整体水平证明了异丙酚可上调Annexin A1的表达,抑制p38MAPK磷酸化,最终抑制炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-a的释放达到抗炎作用.(2)细胞水平实验证明异丙酚对Annexin A1蛋白的激活呈一定的浓度依赖性,当异丙酚浓度为30μg/ml时,对Annexin A1的激活达到最大效应,当异丙酚浓度为50μg/ml时,Annexin A1的表达减少。(3)异丙酚对MAPK家族的影响：LPS刺激THP-1细胞可促进p38MAPK、ERK1/2及JNK1/2的磷酸化,异丙酚干预后可通过抑制p38MAPK及ERK1/2的磷酸化发挥抗炎作用,但与JNK1/2的磷酸化无明显相关性。(4)异丙酚可通过上调THP-1细胞中Annexin A1的表达从而抑制p38MAPK磷酸化水平从而抑制炎症因子IL-1β、IL-6和达到抗炎作用。