目的流感病毒引发的急性呼吸道传染病简称为流感,每年的冬春季节是高发。流感病毒极易发生抗原变异,目前疫苗的效果一般；此外,目前西药有一定的抗流感病毒作用,但是毒副作用较强,并且长期使用易产生耐药性。因此,探索我国的中医药宝库,寻找防治流感有效的药物,以及研发新型药剂来抗流感,成为医学工作者很有意义的研究任务。本研究选用流感病毒亚甲型H1N1,A1/黔防/166/85株,感染人肺癌上皮细胞株A549建立模型,考察疏风宣肺方(主要组成药物为牛蒡子、蝉蜕、金银花、连翘、荆芥等)和解表清里方(主要组成药物为黄芩、杏仁、炙麻黄、生石膏、生甘草等)对H1N1感染A549细胞的治疗作用以及其对免疫调节功能的影响。同时,从固有免疫中的模式识别受体TLR(Toll样受体)为研究基点,探讨疏风宣肺方和解表清里方体外抗病毒作用,及两方药发挥免疫调节作用的分子机制；同时观察疏风宣肺和解表清里两方药对病毒感染细胞内炎性因子以及凋亡相关因子的调控作用。基因芯片技术广泛应用于药物对机体免疫系统调节的研究中,在探索药物靶向方面应用也十分广泛。本研究采用基因芯片技术,研究细胞基因谱的差异基因,并力求进一步找到两种方药发挥抗流感作用的有关分子,为两种方药的临床应用提供明确的分子生物学基础和实验依据。方法1.实验一疏风宣肺和解表清里两方药体外抗流感病毒作用方式研究通过细胞病变效应(CPE)观察疏风宣肺和解表清里两方对病毒致细胞病变作用的影响。复苏细胞人肺腺癌上皮细胞A549,调整细胞浓度为1.5×105个每毫升铺板,根据病毒复制周期,设计3个药物抗病毒作用靶点：预防组(Ⅰ)、抗吸附组(Ⅱ)、治疗组(Ⅲ)。分别加入终浓度100TCIDso病毒作用和最大无毒浓度以下对倍稀释的5个浓度疏风宣肺和解表清里两方药液,48小时后计算药物抑制病毒有效率。2.实验二两种方药对流感病毒感染A549细胞全基因表达谱的影响复苏细胞调整细胞浓度为1.5×105个每毫升铺板,将细胞分为正常细胞对照组(A),H1N1感染组(B),达菲对照组0.75μg·ml-1(C),疏风宣肺组2.50μg·ml-1(D),解表清里组2.50μg·ml-1(E)。除细胞对照组外,均使用流感病毒H1N1吸附2h后,弃掉病毒液,PBS清洗2次后,加入上述浓度的药物。加药作用48h后弃去上清,PBS清洗1次后,加入Tris-HCl裂解液,吹打三次,裂解液使得细胞变圆形,飘起,收集细胞裂解液至冻存管中,提取各组总RNA,采用基因组芯片对所有基因组进行分析讨论。3.实验三疏风宣肺和解表清里方药体外调控流感病毒H1N1诱导炎性细胞因子分泌作用的研究将细胞分为正常细胞对照组(A),H1N1感染组(B),达菲对照组(C),疏风宣肺组(D),解表清里组(E)。除细胞对照组外,均使用流感病毒H1N1吸附2h后,弃掉病毒液,PBS清洗2次后,加入上述浓度的药物。加药作用48h,吸上清弃掉,加入细胞裂解液,收集细胞裂解液至EP管中,提取各组总RNA,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)测定炎性细胞因子表达变化。4.实验四疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路作用的研究采用基因芯片技术研究甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后,细胞内模式识别受体TLR3/7信号通路中基因转录的变化。选用荧光定量PCR技术和Western blotting法检测各组细胞中的Toll样受体3(Toll-like receptor 3, TLR3), Toll样受体7(Toll-like receptor 7, TLR7),核因子Kappa B (nuclear factor-Kappa B, NF-κB),髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)的mRNA及蛋白表达的变化。5.实验五疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染的A549细胞凋亡相关因子的影培养人肺腺癌上皮细胞A549,并与甲型流感病毒H1N1感染A549细胞后,以达菲为阳性对照组,利用基因芯片技术研究疏风宣肺方和解表清里方凋亡信号通路中基因转录的变化。同时,采用荧光定量PCR检测各组细胞中的肿瘤坏死因子受体超家族成员6(Fas)及其配体(FasL)、天门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白-3、-8、-9(Caspase-3、-8、-9)的mRNA表达的变化。Western blotting法检测各组细胞中相应因子的蛋白的变化。结果1.实验一疏风宣肺和解表清里两方药体外抗流感病毒作用方式研究以三种方式给予疏风宣肺和解表清里两方药后,培养48小时后加入MTT测定并计算抑制病毒有效率。其中预防组(Ⅰ)疏风宣肺和解表清里各浓度的抑制病毒有效率较低,小于40%；抗吸附组(Ⅱ)各浓度的抑制病毒有效率稍高于预防组,在35%--65%之间；治疗组(Ⅲ)各浓度的抑制病毒有效率较高,均达50%以上,两药浓度在2.50μg·ml-1时,最高抑制有效率可达74.68%和70.24%,且疏风宣肺方优于解表清里方。2.实验二两种方药对流感病毒感染A549细胞全基因表达谱的影响,对疏风宣肺方和解表清里方治疗组的差异基因进行GO term节点富集分析,并与模型组相比。依据P<0.05,且涉及的基因数分别为不小于70和40取GO节点,疏风宣肺方涉及免疫学方面的分子功能为：酶结合(enzyme binding),RNA结合(RNA binding),蛋白激酶活性(protein kinase activity),丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性(protein serine/threonine kinase activity),小分子GT酶结合(small GTPase binding),以及识别蛋白结合(identical proteinbinding)等方面的分子功能作用显著。解表清里方涉及免疫学方面的分子功能为：丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性(protein serine/threonine kinase activity), RNA结合(RNA binding),蛋白激酶活性(protein kinase activity),酶结合(enzyme binding),核苷酸结合(nucleotide binding)以及转录激酶活性(transcription activator activity)等方面的分子功能作用显著。在KEGG数据库中,查找差异基因涉及的相关代谢途径,对其进行深入的分析,依据P<0.05,同时筛选所涉及的基因数不小于3,疏风宣肺方主要调节的代谢途径有：DNA代谢过程(DNA metabolic process), DNA损伤反应(response to DNA damage stimulus),蛋白定位(protein localization),细胞内转运(intracellular transport),细胞器裂变(organelle fission),磷酸代谢过程(phosphate metabolic process)等方面的作用明显。解表清里方主要调节的代谢途径有：细胞对压力的反应(cellular response to stress) DNA损伤反应(response to DNA damage stimulus),成骨细胞分化(osteoblast differentiation), DNA代谢过程(DNA metabolic process),细胞器裂变(organelle fission), DNA损伤修复(DNA repair)和细胞有丝分裂周期(mitotic cell cycle),等方面的作用明显。代谢途径P值较小,差异显著,富集程度较高。疏风宣肺方主要调控的关于细胞成分(CC)为：核内腔(nuclear lumen),胞内细胞器腔(intracellular organelle lumen),腔上包膜(membrane-enclosed lumen),细胞器腔(organelle lumen),细胞内非包膜细胞器(intracellular non-membrane-bounded organelle)和核浆(nucleoplasm)等方面的有显著的作用。解表清里方主要调控的关于细胞成分(CC)为：核内包膜(nuclear envelope),核内腔(nuclear lumen),内膜体系(endomembrane system),细胞器包膜(organelle envelope),腔上包膜(membrane-enclosed lumen),细胞内非包膜细胞器(intracellular non-membrane-bounded organelle)和胞内细胞器腔(intracellular organelle lumen)等方面的有显著的作用。由结果看出,两方药都可以对细胞的免疫应答,细胞增生以及浆膜进行调控。然而,疏风宣肺方在调控细胞凋亡方面的作用优于解表清里方,并且主要毒胞内信号去进行调控,而解表清里方主要对胞外信号区进行调控3.实验三疏风宣肺和解表清里方药体外调控流感病毒H1N1诱导炎性细胞因子分泌作用的研究与细胞对照组相比,H1N1感染组差异表达基因Il1β、Tnf、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2明显上调。疏风宣肺组和解表清里组均对差异基因Il1β、Tnf、Ccl5、IL10、Il6、Ccl2的表达有显著的下调作用。qRT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组IL-1p、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA表达均显著升高。与H1N1感染组比较,疏风宣肺方的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01),解表清里方对IL-1β、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01)。同时,疏风宣肺方对TNF-a和RANTES的调控作用明显优于解表清里方。Western blotting结果与qRT-PCR,基因芯片结果相符合。4.实验四疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路作用的研究在TLR3/7相关信号传导通路中,与细胞对照组相比,H1N1感染组差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbk1、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显上调,疏风宣肺组和解表清里组对差异表达基因Tlr3、Tlr7、Myd88、Nfbkl、Mapk8、Mapk13、Ifna1、Ifnβ1明显下调。qRT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组TLR3/7、MyD88、 NF-κB的mRNA表达均显著升高(均P<0.01)。与H1N1感染组比较,疏风宣肺组和解表清里组的TLR3/7、MyD88、NF-κB的mRNA表达均明显降低(P<0.05或P<0.01),同时,疏风宣肺方与解表清里方相比较,对MyD88的调控有显著差异(P<0.05)。Western blotting结果与qRT-PCR以及基因芯片结果相符合。5.实验五疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染的A549细胞凋亡相关因子的影响通过KEGG pathway分析涉及细胞凋亡信号传导途径。与细胞对照组相比,H1N1感染组差异表达基因Casp3、Casp8、Casp9、Fas、Fasl显著上调,疏风宣肺组和解表清里组对差异表达基因Casp8、Casp7、Fas、Fasl显著下调。qRT-PCR结果显示,与细胞对照组比较,H1N1感染组Caspase-3、-8、-9、Fas、FasL的mRNA表达均显著升高(均P<0.01)。与H1N1感染组比较,疏风宣肺组和解表清里组的Caspase-3、-8、-9、Fas、 FasL的mRNA表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)。同时,疏风宣肺方对Caspase-8和FasL的mRNA下调作用明显优于解表清里方。Western blotting结果与qRT-PCR,基因芯片结果相符合。结论1.实验一疏风宣肺和解表清里两方药体外抗流感病毒作用方式研究疏风宣肺方和解表清里方在一定浓度下有抗病毒作用,主要是通过抑制病毒在感染的A549细胞内生物合成而发挥抗病毒作用,实验结果显示,疏风宣肺方抗病毒有效率高于解表清里方。2.实验二两种方药对流感病毒感染A549细胞全基因表达谱的影响疏风宣肺方涉及免疫学方面的分子功能为：酶结合,RNA结合,蛋白激酶活性,丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性以及小分子GT酶结合等方面；主要调节的代谢途径有：DNA代谢过程,DNA损伤反应,蛋白定位,细胞内转运等方面；主要调控的关于细胞成分为：核内腔,胞内细胞器腔,腔上包膜,细胞器腔,细胞内非包膜细胞器和核浆(等方面作用显著。解表清里方涉及免疫学方面的分子功能为：丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性,蛋白激酶活性,RNA结合,酶结合以及核苷酸结合等方面；主要调节的代谢途径有：细胞对压力的反应,DNA损伤反应,成骨细胞分化,DNA代谢过程,细胞器裂变以及DNA损伤修复等方面；主要调控的关于细胞成为：核内包膜,核内腔,内膜体系,细胞器包膜,腔上包膜,细胞内非包膜细胞器和胞内细胞器腔等方面的有显著的作用。由结果看出,两方药都可以对细胞的免疫应答,细胞增生以及浆膜进行调控。然而,疏风宣肺方在调控细胞凋亡方面的作用优于解表清里方,并且主要毒胞内信号去进行调控,而解表清里方主要对胞外信号区进行调控。3.实验三疏风宣肺和解表清里方药体外调控流感病毒H1N1诱导炎性细胞因子分泌作用的研究疏风宣肺方和解表清里方均可抑制流感病毒感染后细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6、 MCP-1、RANTES的mRNA过表达及蛋白分泌,减轻炎症反应并恢复机体免疫功能的稳定和平衡。疏风宣肺组方中含可以抑制病毒复制和增殖的金银花、连翘、大青叶和板蓝根；解表清里方中药物配伍符合中医“君臣佐使”的配伍原则,将“清、透、解”溶为一体,从而达到排除毒素退热兼而有之,收到最佳的治疗流感效果。4.实验四疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染人肺腺癌上皮细胞A549中TLR3/7信号通路作用的研究疏风宣肺方和解表清里方通过抑制流感病毒H1N1所诱导的TLR3/7信号通路活化,下调NF-κB的转录活性,发挥抗流感病毒的作用。疏风宣肺方对MyD88蛋白的调控作用优于解表清里方,疏风宣肺方中含有金银花、连翘、板蓝根等,具有抑制流感病毒唾液酸酶活性与膜融合的作用,并能抑制病毒复制和直接杀灭病毒作用。解表清里方主药为清热类中药单体黄芩苷,下调流感病毒感染后以TLR3/7介导的MAPK呈递的信号传导通路的活化,进而抑制流感病毒感染诱导的A549细胞凋亡作用和炎性细胞因子过量产生,恢复机体免疫功能的稳定以发挥抗病毒作用；此外结合两方药对病毒感染细胞全基因普表达分析,原因是疏风宣肺方对胞内区调控优于解表清里方,因此,在体外实验中,疏风宣肺方的作用较解表清里方的效果要好。5.实验五疏风宣肺方和解表清里方对流感病毒H1N1感染的A549细胞凋亡相关因子的影响疏风宣肺方和解表清里方均可调控甲型流感病毒感染后细胞内的Caspase-3、-8、-9、 Fas、FasL表达,来发挥对抗流感病毒感染后的细胞凋亡的作用。并且疏风宣肺方对Caspase-8和FasL的mRNA下调作用明显优于解表清里方,说明疏风宣肺方抗病毒优于解表清里方。疏风宣肺方是在银翘散基础上,加减化裁而成。其方中主要药物连翘和金银花对甲型流感病毒感染引起的的MDCK晚期的细胞凋亡有显著抑制作用；此外,板蓝根的有效成分能显著性的抑制甲型流感病毒血凝素活性,并通过免疫调节间接抗病毒。解表清里方是在麻杏石甘汤基础上加减化裁而成,文献报道,麻杏石甘汤能显著降低流感病毒感染的MDCK细胞的凋亡百分率,同时,也能通过促进IFN-y的分泌,促进TNF-a等细胞因子对细胞凋亡的诱导效应。两种方药中均含有黄芩,实验证明黄芩可以直接抗甲型流感病毒,并抑制病毒在宿主细胞内的增殖,还可以通过调控感染细胞周期分布,抑制Caspase-8的激活,并进一步抑制Caspase-3活性,从而抑制流感病毒感染诱导的细胞凋亡。综上所述,本研究结合基因芯片技术与mRNA、蛋白等层面,较为全面分析了疏风宣肺方和解表清里方两种方药对流感病毒H1N1感染A549细胞治疗作用的机理,两方药在体外有明显的抗病毒作用,可以抑制病毒感染后在宿主细胞内的生物合成,下调病毒感染引起的炎性细胞因子,TLR相关信号转导通路以及凋亡相关因子的mRNA和蛋白的表达,并且,疏风宣肺方对于MyD88, Caspase-3和Fasl等mRNA和蛋白的调控作用优于解表清里方,与前期体内试验和临床双盲试验结果相符。