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非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia,NOA)被认为是男性不育症最严重的临床表现,其病因不明,发病机制复杂。我国人口众多,非梗阻性无精症人群基数庞大,目前对于这部分人来说,获得亲代的唯一方法是行卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI),但仍有约50%的患者无法获得正常精子。NOA生精机制的研究亟待解决,深入探索生精功能衰竭的分子机制,有助于我们为临床诊疗提供新的切入点。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)不具备蛋白编码功能,是一种长度约200-100000 nt之间的RNA分子,参与多种生物细胞调控过程,研究发现,lncRNA可通过ceRNA(competing endogenous RNAs)机制参与细胞凋亡,进而影响p53等经典凋亡途径以调控癌症细胞凋亡。前期研究中,我们发现NOA睾丸组织中MEG3与miR-188-3p表达水平有统计学意义,实验验证二者存在负向调控关系,生物信息学分析预测其可能存在潜在结合位点,提示两者之间可能存在ceRNA作用机制。P53基因编码一种分子量为43.7KDa的蛋白质,参与经典凋亡通路,诱导细胞凋亡。Apaf-1为一种重要的凋亡因子,参与构成凋亡小体,相关研究表明lncRNA可通过ceRNA调控凋亡因子,进而影响非梗阻性无精症中的精子发生,另有研究报道lncRNA MEG3可通过ceRNA机制调节Apaf-1、p53的表达,促进癌细胞凋亡。近年来,对于lncRNA MEG3及p53的研究多集中在癌症方面,对于非梗阻性无精症的相关研究少有报道。本课题组前期研究表明,lncRNAMEG3在NOA患者组织中高表达、miR-188-3p低表达,生物信息学预测二者可能存在潜在结合位点,前期预实验表明,干扰MEG3后NT-2细胞株中p53、apaf-1表达水平显著下降,提示MEG3可能通过调控p53、apaf-1参与精子的发生过程。结合相关研究进展,本研究提出假说:lncRNA MEG3可能通过ceRNA机制调控p53、apaf-1表达,使NOA患者睾丸组织中凋亡水平增高,从而参与凋亡通路影响NOA精子发生。目的:通过构建双荧光素酶实验,验证miR-188-3p与lncRNA MEG3的结合位点,通过干扰lncRNA MEG3后检测p53及apaf-1的表达,探讨lncRNA MEG3与p53、apaf-1的基因调控过程。方法:1.实验分组:组织分为NOA睾丸组和正常睾丸组;细胞实验分为干扰lncRNA MEG3组和未干扰lncRNA MEG3组;2.通过qRT-PCR、Western-Blot检测lncRNA MEG3、p53、apaf-1在NOA睾丸组织中的表达情况,免疫荧光法在NTERA-2细胞株中对p53、apaf-1定位;3.miR-188-3p/lncRNA MEG3 相关性研究,预测 miR-188-3p/lncRNA MEG3 结合位点,使用 miR-188-3p mimic/mimic NC 转染NTERA-2 细胞,构建 lncRNA MEG3 3’UTR的野生型(WT)及突变型(MUT)质粒,共转染及双荧光素酶报告基因实验验证二者的靶向关系;4.研究lncRNA MEG3对凋亡通路的影响,通过lncRNA MEG3的siRNA及对应的阴性对照物(negative control,NC)转染NTERA-2细胞,qRT-PCR、Western-Blot等方法研究p53、Aapf-1在两组中的表达情况,免疫荧光法鉴定p53蛋白、apaf-1蛋白在转染后NTERA-2细胞中聚集的程度变化;5.流式细胞仪分析转染后细胞凋亡情况,通过透射电镜观察转染后各组细胞中凋亡小体的数量变化。结果:1.生物信息学提示,lncRNA MEG3是miR-188-3p的靶基因。双荧光素酶实验结果显示,过表达miR-188-3p后,lncRNAMEG3 3’UTR-WT荧光素酶活性低于对照组(p<0.05),lncRNA MEG3 3’ UTR-MUT荧光素酶活性与对照组差异无统计学意义(p>0.05)。2.2.qRT-PCR、Western-Blot检测到p53和apaf-1在NOA睾丸组织中较正常睾丸组织表达水平升高(p<0.05);免疫荧光结果显示,p53蛋白、apaf-1蛋白表达在NTERA-2在细胞核和细胞质中均有分布;3.在细胞株中使用siRNA干扰lncRNA MEG3后,与未干扰对照组相比,p53和apaf-1表达水平均降低(p<0.05)。免疫荧光结果提示,p53与apaf-1在细胞质和细胞核中均有分布,主要分布在细胞核中。siRNA干扰后,p53蛋白在细胞质中的表达减少,apaf-1蛋白则无明显变化。透射电镜结果提示,干扰lncRNA MEG3组较阴性对照组凋亡小体数量减少。流式细胞分析学结果提示,干扰MEG3后实验组早、晚期凋亡细胞数均较对照组减少。结论:1.miR-188-3p 是 lncRNA MEG3 的靶基因,lncRNA MEG3 可能调控miR-188-3p影响细胞的凋亡水平参与NOA的发生发展。2.p53和apaf-1在NOA组睾丸织中高表达,干扰lncRNAMEG3后p53、apaf-1表达水平降低,细胞凋亡水平减少,提示lncRNA MEG3可能通过调控p53、apaf-1参与NOA患者中凋亡的发生过程。