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海藻，是海洋中蕴藏的巨大的生物资源之一。由于其再生的特性，海藻被认为是第三代生物燃料和化学品。琼脂糖是红藻细胞壁的主要成分，琼胶酶能够水解琼脂糖生成琼胶寡糖。新琼寡糖水解酶能断裂新琼寡糖的α-1,3糖苷键生成单糖。与酸水解相比，酶水解法以特异性强、产物均一等优点，已经成为红藻应用的发展趋势。琼胶寡糖具有多种生物活性，已广泛应用于制药、食品、化妆品等行业，但是这些应用在很大程度上依赖于琼胶酶的高质量大规模生产。 本实验室前期发现Catenovulum sp.X3来源的琼胶酶AgaXa属于耐高温酶，具有很高的稳定性，并构建了产琼胶酶工程菌E.coli BL21（DE3）-pET32a-AgaXa。通过对重组菌株的培养基成分及发酵条件进行优化，使得重组琼胶酶的产量有了明显的提高。优化后的培养基成分为5g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、15g/L蛋白胨；培养条件为pH7.5、诱导温度30℃、0.1mM IPTG。在5L的发酵罐内利用线性补料的方式，琼胶酶AgaXa酶活力高达1.5×104U/L，比未优化发酵的琼胶酶产量提高了6倍。发酵液经离心、活性炭、超滤等初步处理后，利用镍柱亲和层析纯化琼胶酶，制备液体酶制剂。为了提高琼胶酶的热稳定性，通过单因素和响应面实验对酶保护剂的成分进行优化，优化后的酶制剂成分为1.8mM Na+、甘油16.97％、果胶2.1g/L、葡萄糖10.37g/L。添加优化的酶保护剂后，在高温85℃温浴1h后，琼胶酶依然有80%酶活残留率。 作为第三代生物燃料的原材料，琼脂糖不能被酿酒酵母直接利用，其水解需要琼胶酶和新琼寡糖水解酶的共同参与才能产生酵母能直接利用的单糖。从菌株Aquimarina agarilytica ZC1中克隆了新琼寡糖水解酶NH852基因，进一步构建重组质粒，转入酿酒酵母EBY100中构建重组表面展示菌EBY100-pYD1-NH852。在半乳糖培养基诱导48h后，酶活力达到最高。对重组新琼寡糖水解酶的酶学性质进行研究发现：重组酶NH852的最适反应温度是30℃，当温度高于40℃后酶活力迅速下降，在25～35℃酶的稳定性较高；最适pH为6.0，在pH为6.0～10.0时酶活力相对稳定。Ni+在0.1mM时对酶活力有促进作用（达160%），Mg2+在5mM时对酶活力有促进作用（达155%），而Fe3+、Cu2+等金属离子及SDS等还原剂对酶活有明显抑制作用。重组酶水解PNPG（4-硝基苯基-D-半乳糖苷）的Vmax值为27.03U/mg，Km值为0.0625mg/mL。 本实验室前期证实不同于琼胶酶AgaXa具有多种水解产物（主要是新琼八糖和新琼十糖，还有少量的新琼六糖和新琼十二糖），Aquimarina agarilytica ZC1来源的β-琼胶酶Aga575水解琼脂糖得到唯一的产物新琼二糖。首先琼胶酶Aga575以3U/mg的酶活力水解琼脂糖，琼脂糖基本完全水解、形成新琼二糖。进一步将10g/L新琼二糖添加到培养基中作为唯一碳源，重组酿酒酵母EBY100-pYD1-NH852可以对新琼二糖实现同步糖化发酵，最终乙醇产量为0.8g/L。