背景和目的牙周炎是常见的以牙菌斑为始动因子的细菌感染性疾病,是我国成年人牙齿缺失的主要原因之一。牙周炎的临床主要表现是牙龈炎、牙槽骨吸收以及牙周袋形成。牙周炎的主要致病菌是革兰氏阴性厌氧杆菌。牙周致病菌侵入机体后,细菌及其代谢产物会激发宿主的免疫反应,分泌炎性因子。其中,引起牙周炎的两种最常见的炎性因子是肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）。他们发生致炎作用的同时也会诱导产生更多的炎性介质,引起牙周支持组织的免疫炎性反应。炎性因子不仅在龈沟液中含量较高,血清中的含量也高于正常。目前牙周炎的治疗方法主要是牙周基础治疗和应用抗生素。由于抗生素的耐药性问题,限制抗生素应用已成为医学发展的必然趋势,探寻新的牙周炎治疗方法十分必要。人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts,HGFs）是牙周组织的主要组成成分,也是牙周组织最主要的防御屏障,参与牙周组织的病变、修复和改建等重要的生理、病理过程。牙周组织发生炎性反应时,当免疫活性细胞及其分泌的炎性因子在牙周组织中发生浸润时,就会引发红肿热痛等一系列牙周炎的表现。HGFs是研究牙周炎发生发展病理过程的主要研究对象之一。在人体内对牙周炎的发生发展进行直接研究受到各种条件的限制,因此,通过分离培养HGFs建立体外牙周炎模型,是目前我们研究牙周疾病的有效手段之一。紧密连接（tight junction,TJ）和黏附连接（adherens junction,AJ）是细胞间连接的主要组成部分。在生理或病理条件下,细胞间通透性的改变,主要是通过调节二者蛋白的表达和分布来调控的。ZO-1是紧密连接结构的关键组成部分,ZO-1如果受到影响,紧密连接的结构也会遭到破坏。VE-cadherin和β-catenin属于黏附连接。AJ的主要功能是保存细胞的形态,维持组织结构的整体性。正常情况下,细胞间的缝隙只有0.1～0.3 μM,对溶质的转运限制条件苛刻,大分子物质无法通过细胞间的缝隙进行转运。当发生炎症反应时,组织结构的完整性遭到破坏,炎症因子会引起黏附连接和紧密连接的裂解,ZO-1、VE-cadherin和β-catenin从细胞连接处分离,细胞间的缝隙增大,内皮对溶质分子的限制作用减弱,这也是炎症情况下细胞间通透性增加的主要途径。因此,连接分子ZO-1、VE-cadherin和β-catenin可以作为评价细胞通透性的指标。人体内血红素代谢后会产生一氧化碳（carbon monoxide,CO）。学者们研究发现不仅是内源性CO,外源性CO也具有抗细胞凋亡、抗炎和参与机体免疫应答反应的作用。一氧化碳释放分子（carbon monoxide releasing molecules,CORMs）是一种人工合成的化合物,在机体需要时,通过溶于相应的溶剂能够缓慢可控地释放CO,满足机体的各种需求。CORMs也具有抗炎、抗凋亡等各种生理功能。课题组前期对CORMs的抗炎特性分别进行了体内、体外实验研究,发现CO不仅能够维持血管内皮细胞的稳定,在多种生理病理过程中也发挥重要作用。CORM-3是CORM的第三代研发产品,在水中溶解迅速,使用更加便捷,能够更加精准地控制CO的释放速率,具有较高的科研及未来临床应用价值。血红素氧化酶（Heme oxygenase,HO-1）是人体内血红素降解的限速酶。血红素经氧化酶解后代谢产生胆绿素、游离铁和CO。HO有多种同工酶,常见的有HO-1、HO-2等,其中HO-1是一种非常容易被诱导的酶,可被多种刺激因素诱导产生较高的表达水平。HO-1不仅能够保护细胞,还参与体内的一系列免疫应答反应。课题组前期研究发现,CORM-3发挥抗炎作用的同时在多种细胞中都会引起血红素氧合酶-1的高表达。研究还发现CORM-3不仅可以抑制TNF-α和IL-1β共同刺激下HGFs中黏附分子的表达;CORM-3还可以抑制尼古丁和脂多糖共同刺激下HGFs中炎性因子与破骨细胞相关因子的表达。然而CORM-3对炎性环境下HGFs细胞间通透性的影响目前尚未见相关报道。基于以上研究背景,本研究将HGFs作为体外研究对象,以TNF-α和IL-1β共同刺激模拟体外炎性环境,研究CORM-3对炎性环境下HGFs细胞间连接分子VE-catenin、ZO-1以及β-cadherin表达的影响,并探究其可能的作用机制。建立实验性大鼠牙周炎模型,研究CORM-3对实验性牙周炎大鼠牙龈组织连接分子VE-catenin、ZO-1以及β-cadherin表达的影响及机制,探讨CORM-3在牙周炎治疗中对细胞通透性的影响,以期为牙周病的治疗提供新的治疗策略和理论依据。材料和方法1.分离培养人牙龈成纤维细胞筛选18～24周岁的年轻健康患者,收集因牙齿阻生拔除埋伏牙时或牙龈切除术时获得的牙龈组织,严格无菌操作,用酶解组织块法培养HGFs。筛选细胞活力旺盛的第3～5代HGFs进行后续实验研究。2.CCK-8方法检测不同浓度CORM-3对HGFs细胞活性的影响将细胞分别于含0、100 μM、200μM、400μM、800 μM的CORM-3溶液预处理6小时后,加入浓度为10 ng/ml的TNF-α和2 ng/ml的IL-1β培养24小时,采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）方法检测不同浓度CORM-3对HGFs细胞活性的影响,筛选出CORM-3安全的实验浓度范围。3.CORM-3对炎性环境下HGFs细胞连接分子的表达的影响选用状态良好的第3～5代HGFs,分别于0、100 μM、200 μM、400 μM的CORM-3溶液预处理6小时后,加入浓度为10 ng/ml的TNF-α和2 ng/ml的IL-1β营造体外炎性环境,培养24小时,采用免疫荧光染色、RT-qPCR和Western blot方法检测CORM-3对炎性环境下细胞连接分子β-catenin,VE-cadherin以及ZO-1表达的影响。4.CORM-3对TNF-α和IL-1β刺激下单层HGFs细胞通透性的影响选用状态良好的第3～5代HGFs,采用Transwell小室建立单层细胞模型,分别于0、100 μM、200 μM、400 μM的CORM-3溶液预处理6小时后,加入浓度为10 ng/ml的TNF-α和2 ng/ml的IL-1β培养24小时,营造体外炎性环境,用FITC-BSA方法检测CORM-3对炎性环境下单层HGFs细胞通透性的影响。5.CORM-3对人牙龈成纤维细胞HO-1表达的影响选用状态良好的第3～5代HGFs,分别用200 μM的CORM-3或完全释放掉CO的iCORM-3预处理HGFs 6小时,然后加入浓度为10 ng/ml的TNF-α和2 ng/ml的IL-1β营造体外炎性环境,采用RT-qPCR和Western blot的方法检测CORM-3对炎性环境下人牙龈成纤维细胞中HO-1表达的影响。6.CORM-3对炎性环境下HGFs连接分子表达的影响机制选用状态良好的第3～5代HGFs,使用HO-1 siRNA进行转染后沉默HO-1基因,浓度为200 μM的CORM-3预处理HGFs 6小时,然后加入浓度为10 ng/ml的TNF-α和2 ng/ml的IL-1β营造体外炎性环境,HO-1 siRNA转染后,以RT-qPCR和Western blot方法检测CORM-3对炎性环境下HGFs细胞连接分子β-catenin,VE-cadherin以及ZO-1基因及蛋白表达的影响,研究CORM-3对炎性环境下HGFs细胞连接分子表达的影响机制。7.实验性大鼠牙周炎模型中CORM-3对大鼠牙龈组织连接分子表达的影响及机制研究（1）建立实验性大鼠牙周炎模型实验选用雄性Wistar大鼠,共32只,随机分为四组（每组8只）:正常组（NL组）、牙周炎组（chronic periodontitis,CP 组）、CORM 组（carbon monoxide releasing molecule-3,CORM 组）和 ZPP-Ⅸ组（原卟啉九锌,zinc protoporphyrin-9,ZPP-IX组）。除正常组外,其余三组均采用正畸结扎方法建立实验性大鼠牙周炎模型。CORM组和ZPP-Ⅸ组腹腔注射CORM-3（10 mg/kg/d）,ZPP-Ⅸ组腹腔注射HO-1抑制剂ZPP-Ⅸ（10 μmol/kg/d）,CP组和正常组注射等体积生理盐水,每两天一次,实验周期为10天。实验中的CORM-3溶液均为新鲜配置。（2）CORM-3对大鼠牙龈组织连接分子表达的影响及机制研究结扎后第十天,过量麻醉处死大鼠,制备牙周炎模型上颌骨标本。一侧上颌骨标本将附着的牙龈组织取下并分装到多个无菌EP管中,通过RT-qPCR和Western blot方法,检测CORM-3对牙周炎模型大鼠牙龈组织HO-1和连接分子ZO-1、VE-cadherin、β-catenin基因及蛋白表达的影响;另一侧上颌骨标本经固定、脱钙、包埋后制作常规石蜡切片,免疫组化染色检测CORM-3对牙周炎模型大鼠牙龈组织HO-1和连接分子ZO-1、VE-cadherin、β-catenin表达的影响,研究CORM-3对大鼠牙龈组织连接分子表达的调控机制。8.统计学分析实验采用GraphPad软件进行统计学分析,两组数据之间的差异采用Turkey’s multiple comparisons test检验方法,P<0.05,差异有统计学意义。结果1.体外分离培养HGFs牙龈组织培养三天左右,观察到组织块周围有长梭形的成纤维细胞缓慢生长,细胞排列呈放射状,约一周即可长满瓶底,进行细胞传代培养,细胞活力良好的情况下,HGFs的长梭形外形均匀一致,传代细胞长满瓶底后会呈现漩涡状外观。选取细胞活力旺盛的第3～5代HGFs进行后续实验。2.CORM-3对人牙龈成纤维细胞细胞活性的影响CCK-8检测结果显示100 μM、200 μM和400 μM浓度CORM-3预处理后的细胞活力与对照组相比没有统计学差异,说明实验选用100μM、200 μM和400μM浓度的CORM-3对HGFs是相对安全的;而800 μM浓度的CORM-3培养的HGFs与正常组相比,细胞活力明显下降（P<0.001）,且差异有统计学意义,说明800 μM的CORM-3对HGFs有一定的毒性作用。提示100 μM、200 μM和400μM为CORM-3作用于HGFs的安全浓度范围。3.CORM-3对TNF-αα和IL-1β刺激下人牙龈成纤维细胞连接分子表达的影响HGFs免疫荧光检测显示:正常组的HGFs细胞膜的边界清晰完整,呈均匀线性,染色亮度高;炎性因子组的HGFs细胞的完整性遭到破坏,细胞膜染色不连续,边界模糊,颜色暗淡,细胞排列紊乱;随CORM-3浓度的增加,HGFs的细胞膜完整性有所恢复,亮度增加,细胞逐渐恢复正常结构状态,炎性环境下CORM-3对细胞连接分子VE-cadherin、β-catenin、ZO-1表达的增强作用有剂量依赖性,在CORM-3浓度200μM时作用最强。RT-qPCR、Western blot量化研究结果显示,与正常组相比,炎性因子组中HGFs连接分子VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的mRNA和蛋白表达水平均呈现下降趋势,加入CORM-3可以增强炎性环境下HGFs细胞连接分子的表达,且在CORM-3浓度为200 μM时作用最显著（P<0.001）,差异有统计学意义。选取200 μM作为后续实验中CORM-3的实验浓度。4.CORM-3对TNF-α和IL-1β刺激下单层HGFs细胞通透性的影响采用FITC-BSA方法检测炎性环境下CORM-3对单层HGFs细胞通透性的影响。FITC-BSA检测结果表明炎性因子的加入能增大单层HGFs的细胞通透性（P<0.001）,CORM-3可以降低HGFs细胞膜通透性（P<0.05）,且在浓度为200 μM时作用效果最明显（P<0.001）,差异均有统计学意义。5.CORM-3对TNF-α和IL-1β刺激下人牙龈成纤维细胞HO-1表达的影响以 10 ng/ml 的 TNF-α 和 2 ng/ml 的 IL-1β 作用于 HGFs,HO-1 的 mRNA 和蛋白表达较对照组有显著提高（P<0.05）;与炎性因子组相比,浓度200 μM的CORM-3能显著提高炎性环境下的HGFs中HO-1的mRNA和蛋白表达（P<0.001）;而CO全部释放掉的iCORM-3则丧失了对HO-1表达的调节作用（P>0.05）,差异均有统计学意义。说明炎性因子能提高HO-1的mRNA和蛋白表达量,浓度200 μM的CORM-3能够显著提高炎性环境下的HGFs中HO-1的mRNA和蛋白表达。6.CORM-3对TNF-α和IL-1β刺激下人牙龈成纤维细胞连接分子表达的影响机制采用HO-1 siRNA转染的方法沉默HO-1基因,与正常组相比,HGFs细胞连接分子VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的mRNA和蛋白表达水平均显著下降（P<0.01）;HO-1基因沉默后,200 μM的CORM-3丧失了对炎性环境下的HGFs连接分子VE-cadherin、β-catenin、ZO-1表达的调节作用,与正常组相比差异无统计学意义。实验结果证实:CORM-3对炎性环境下人牙龈成纤维细胞连接分子VE-cadherin、β-catenin以及ZO-1表达的增强作用是通过HO-1通路进行的。7.实验性大鼠牙周炎模型中CORM-3对大鼠牙龈组织连接分子表达的影响及机制研究（1）大鼠牙周炎模型的建立大鼠一般情况良好,未发现结扎丝脱落、断裂的情况,进食及精神状况良好。大鼠上颌第一磨牙结扎后牙颈部有菌斑堆积,一周后,大鼠实验牙牙龈红肿、探诊出血,可以探到牙周袋。大鼠牙周炎模型在建模10天后,正常组大鼠牙龈无炎症表现;CP组大鼠牙龈炎症,探诊出血,表现为中度牙周炎,有浅牙周袋出现。与正常组相比较,CP组、CORM组和HO-1被抑制的ZPP-IX组的牙龈出血指数均有显著升高（P<0.05）,显示牙周炎建模成功。CP组、ZPP-IX组的探诊深度均显著高于正常组（P<0.001）;CORM组的探诊深度与正常组相比差异无统计学意义（P>0.05）。（2）CORM-3对实验性牙周炎大鼠牙龈组织连接分子表达的影响及机制RT-qPCR和Western blot结果显示,与正常组相比,牙周炎CP组大鼠牙龈组织连接分子VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的mRNA和蛋白表达水平均下降（P<0.001）;CORM组的大鼠牙龈组织连接分子的表达较CP组则有显著增高（P<0.01）;ZPP-IX组因抑制了 HO-1的活性,大鼠牙龈组织连接分子的表达较正常组显著降低（P<0.01）,差异有统计学意义。CORM-3对实验性牙周炎大鼠牙龈组织HO-1表达的影响与CORM-3对实验性牙周炎大鼠牙龈组织连接分子的影响趋势吻合,差异有统计学意义。免疫组化结果显示:与正常组相比,牙周炎CP组大鼠牙龈组织连接分子VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表达明显降低,染色较浅,有深牙周袋形成;CORM组大鼠牙龈组织连接分子的表达较正常组显著增强,染色加深,牙龈乳头较完整;ZPP-IX组因抑制了 HO-1的活性,大鼠牙龈组织连接分子VE-cadherin、β-catenin、ZO-1的表达明显降低,染色较浅,有牙周袋形成。结论1.CORM-3能够促进炎性环境下HGFs连接分子β-catenin、VE-cadherin和ZO-1的表达,且在浓度为200μM时效果显著。2.200 μM的CORM-3能显著增强人牙龈成纤维细胞HO-1的表达,且该作用是通过CORM-3释放的CO介导的。3.炎性环境下CORM-3对人牙龈成纤维细胞连接分子ZO-1、VE-cadherin和β-catenin的调节作用是通过HO-1通路实现的。4.CORM-3能够增强实验性牙周炎大鼠牙龈组织连接分子ZO-1、VE-cadherin和β-catenin的表达,抑制炎性反应,该调节作用是通过HO-1通路实现的。创新及意义ZO-1、VE-cadherin和β-catenin是维持组织结构完整性的主要连接分子,也是评价细胞通透性的重要参考指标。炎性状态下人牙龈成纤维细胞细胞通透性的改变对牙周炎的发生发展有重要影响。因此,维持或升高细胞连接分子的表达,降低炎性环境诱导的细胞通透性的升高,是抑制炎性反应的有效手段。CORM-3对炎性环境下人牙龈成纤维细胞通透性的影响及机制研究是本实验的创新之处。本实验以细胞连接分子VE-catenin、ZO-1以及β-cadherin为研究靶点,通过炎性因子刺激人牙龈成纤维细胞模拟牙周炎炎性环境,并建立实验性大鼠牙周炎模型进行体内研究。通过体内、体外实验模型,研究CORM-3对炎性环境下牙龈成纤维细胞及牙龈组织连接分子表达的影响,并探讨了 HO-1通路在CORM-3调控作用中的地位,为牙周炎的治疗提供了全新的思路。