鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南方地区相对高发的恶性肿瘤，发病隐匿，症状不明显，致使其诊断较为困难，大量基础和临床研究表明NPC发病是一个多因素，多阶段的过程，主要与EB病毒，化学致癌物以及遗传等因素有关。发生远处转移，治疗后易复发是其致死的主要原因。对于鼻咽癌的临床早期诊断，监控疾病发展过程，评估治疗效果，一直都是鼻咽癌研究的重点和难点。因此对于鼻咽癌相关生物标志物的研究就有十分重要的意义。 蛋白质组学(Proteomics)技术作为后基因组时代的一种高通量研究方法，近年来广泛应用于人类疾病，尤其是肿瘤方面的研究当中。蛋白质组学是：细胞或组织基因组所表达的全部蛋白质，是一门研究蛋白质结构，活性，翻译后修饰，亚细胞定位及分子间相互作用的科学。蛋白质是各种生物功能的直接执行者，蛋白质组学通过整体研究的方法，对蛋白质的数量，活性，不同生理或病理条件下的改变情况进行研究，其研究成果可用于各种疾病的早期诊断，监测疾病过程，发现新药物作用靶点等临床应用。蛋白质组学的核心技术是利用双向凝胶电泳(2DE-PAGE)根据等电点(pI)的差异和分子量(Mw)的大小来分离不同的蛋白，通过生物质谱分析获取蛋白质的肽指纹图谱(PFM)，最终运用生物信息学手段进行数据库匹配得到蛋白质的相关信息。 血清蛋白质组学(serum proteomics)主要是运用蛋白质组学相关技术发现与各种疾病相关的血清蛋白，并对其发现的具有特殊意义的蛋白质进行特性，结构和功能的相关研究。血清蛋白质成分的种类，含量都会随着不同的生理，病理过程而发生相应的改变，这就使得某些特异性血清蛋白质有可能成为疾病临床诊断的特异性标志。 肿瘤实际上是细胞失去了对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物，这也意味着在肿瘤发生发展的过程中肿瘤细胞能自身分泌某些特定的蛋白质分子或者是过度表达某些蛋白质，这些“特殊”的蛋白分子被肿瘤细胞分泌释放，因此在肿瘤细胞分泌上清液中存在许多与肿瘤发生，发展相关的蛋白质分子，这些分子的存在即能直接刺激肿瘤细胞的生长维持其异型性的特点，又与肿瘤的侵袭转移这一生物学特性密切相关，作为一种分泌因子，它既可以影响肿瘤细胞本身的生长分化，也可以通过机体的循环系统改变整体的内环境，最终导致肿瘤的无限增殖和远处转移。从肿瘤细胞中释放入血的这些蛋白质，被认为是一类肿瘤标志物的候选分子。因此，本实验的目的在于，利用蛋白质组学技术，对NPC细胞培养上清液及NPC裸鼠模型血清进行研究，寻找与NPC相关的血清标志物。研究方法 本实验运用蛋白质组学相关技术方法开展课题研究。 1．运用细胞裂解的方法提取鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B总蛋白质，通过试验不同裂解液成份，调整2DE等点聚焦参数的设置，比较不同pI范围IPG胶 条实验结果，对鼻咽癌细胞株进行蛋白质组学研究。 2．利用无血清培养基对5-8F，6-10B细胞进行培养，收集肿瘤细胞培养上清液，以25％三氯醋酸(TCA)沉淀上清液总蛋白，随后以含0.007％β-巯基乙醇丙酮洗涤沉淀的方法进行蛋白质的浓缩和纯化。加入适量裂解液结合超声粉碎，得到适用于2DE的肿瘤细胞培养上清蛋白质样品，进行相应蛋白质组学研究。 3．收集5-8F；6-10B原位种植成功的NPC裸鼠模型血清及对照组同年龄，同性 别未致瘤裸鼠血清样本，采用不同分组类型的蛋白质样本进行混合的策略，在不同的pI范围的IPG胶条(pH3-10NL，pH4-7)下进行2DE，利用 ImageMaster5.0分析软件以对照组血清2DE图谱作为参考，对5-8F，6-10B 血清2DE图谱进行差异分析，最终进行差异蛋白质的质谱鉴定。研究结果本研究利用以建成的鼻咽癌裸鼠模型血清作为实验样本，结合鼻咽癌细胞株培养上清液蛋白质组学研究结果，探索鼻咽癌相关的血清蛋白质改变情况，为寻找NPC相关的血清标志物提供可能的线索。 本课题进行了如下工作： 1．利用双向凝胶电泳技术，通过对鼻咽癌细胞株5-8F和6-10B的实验，稳定和优化了蛋白质提取方法及等电聚焦中的各种条件，建立了分辨率高重复性好的2DE图谱。 2．对5-8F，6-10B鼻咽癌细胞培养上清液进行蛋白质组的研究，比较分析 两者蛋白质表达谱的差异：5-8F组特有的8个蛋白质差异点，6-10B组有31个明显蛋白质差异点。根据2DE图谱提供的蛋白质等电点以及分子量的信息，以SwissProt蛋白质数据库中已有的肿瘤细胞培养上清液2DE图谱作为参考，通过软件辅助和生物信息学手段，检索差异蛋白的相关数据，获取了差异蛋白质功能的初步信息，最终选取其中的8个点进行质谱鉴定。MALDI-TOF质谱结果，5—8F特异表达的蛋白有：参与连环蛋白(一种细胞骨架蛋白，分α，β,γ三种)降解的Calcyclin-binding protein；6—10B特异表达的Peroxiredoxin-1，参与细胞内的氧化还原反应。 3．建立了稳定性较好的鼻咽癌裸鼠血清蛋白质2DE方法，并比较了不同转移能力裸鼠血清与对照组裸鼠血清蛋白质2DE图谱之间的差异，通过不同pI范围IPG胶条的重复实验，最终获得NPC裸鼠血清蛋白质表达谱的差异：5-8F组增加了3个蛋白质点，6-10B组增加了4个蛋白质点。利用MALDI-TOF质谱技术对血清差异蛋白点进行鉴定，发现SAA-1(serum amyloid A-1 protein)相较对照组裸鼠血清和5—8F组血清，在6—lOB组血清中具有明显的表达差异。 结论 本实验运用双向凝胶电泳(2DE)的方法，分别对鼻咽癌细胞培养上清液，和鼻咽癌裸鼠模型血清蛋白质组进行研究。通过与对照组血清的比较，在鼻咽癌裸鼠模型血清中SAA—1(serum amyloid A-1 protein)蛋白的表达具有显著性差异，为寻找鼻咽癌血清生物标志物提供了有利的线索。