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热纤梭菌是一种嗜热的革兰氏阳性厌氧细菌,能够分泌多种降解纤维素、半纤维素的酶类,在细胞表面自组装为多酶复合物-纤维小体,高效地降解纤维素;热纤梭菌同时能够利用多糖降解产物代谢产生乙醇、氢气等能源产物,是自然界中少见的能够同时降解纤维素,并发酵产生能源物质的微生物,因而具有巨大的经济价值和研究意义。
热纤梭菌的细胞表面结构对降解酶的功能及多糖降解底物的吸收有重要影响。本论文以热纤梭菌的细胞壁为研究对象,展开了蛋白质组学研究。采用高浓度的SDS煮沸的方法制备了热纤梭菌的细胞壁组分;利用mutanolysin酶解肽聚糖,释放胞壁蛋白。通过双向电泳分离和MALDI-TOF/TOF质谱鉴定到132个蛋白。根据COG功能分类,检测到的132个细胞壁蛋白可以分为15个功能类别。其中,参与能量生成与转化的蛋白最多,占到20.5%。除了参与细胞壁代谢的FtsZ,MinD等蛋白外,还检测到许多参与生物能代谢的酶,如乙醇脱氢酶和氢化酶等。
糖蛋白荧光染色实验发现,细胞壁蛋白中可能存在糖蛋白。以RNase B为模式糖蛋白,建立了不同非特异性蛋白酶组合胶内酶切及分离纯化糖肽的方法。改进了基质条件,即采用CMBT结合DHB的双层点样方法,有效的改善结晶状态,提高了质谱分析的灵敏度和重复性。在此基础上,通过糖肽的质谱鉴定,确定CbpB蛋白为糖蛋白。这也是热纤梭菌中鉴定到的第二个糖蛋白。CbpB蛋白的高表达丰度和糖基化修饰,反映了其在底物寡糖运输方面的重要作用。本论文的研究结果表明,热纤梭菌的细胞壁蛋白是细胞总蛋白的重要组成部分,有可能发挥着重要的生理作用。