【摘 要】
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[目的]在脊髓损伤的病理生理过程中存在两个主要因素导致了神经修复困难,一是损伤急性期的细胞兴奋性毒性环境导致的继发损伤级联反应,二是损伤中后期的星形胶质细胞过度激活和增殖导致的胶质瘢痕增生构成了神经再生的屏障。为了同时克服这些困难以修复脊髓损伤,本研究构建了负载嘌吗啡胺（purmorphamine,PUR）和维甲酸（retinoic acid,RA）的氧化镁/聚（L-丙交酯-co-ε-己内酯）（M
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（No.2016YFC1100203、No.2020YFC1107402）；
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[目的]在脊髓损伤的病理生理过程中存在两个主要因素导致了神经修复困难,一是损伤急性期的细胞兴奋性毒性环境导致的继发损伤级联反应,二是损伤中后期的星形胶质细胞过度激活和增殖导致的胶质瘢痕增生构成了神经再生的屏障。为了同时克服这些困难以修复脊髓损伤,本研究构建了负载嘌吗啡胺（purmorphamine,PUR）和维甲酸（retinoic acid,RA）的氧化镁/聚（L-丙交酯-co-ε-己内酯）（Magnesium Oxide/Poly[L-lactide-co-ε-caprolactone],MgO/PLCL）静电纺丝支架,探究其理化特性和生物相容性,检测其神经保护能力、诱导神经干细胞（neural stem cells,NSCs）分化能力,并研究其修复小鼠脊髓半切损伤的可行性。[方法]材料制备与表征:使用硝酸镁和甘氨酸以燃烧法制备介孔 MgO纳米颗粒,以不同配比与PLCL混合（0:100、10:100、25:100、50:100）并通过静电纺丝制备取向性MgO/PLCL支架;将MgO纳米颗粒吸附负载PUR和RA后再与PLCL静电纺丝,制备载药的MgO/PLCL支架（MgO/PLCL+PUR/RA）;检测MgO纳米颗粒的载药能力;检测不同配比MgO/PLCL支架的微观形貌特点、力学拉伸性能、亲水性和Mg2+释放特性;检测MgO/PLCL（25:100）支架的降解特性和酸性中和作用。体外细胞试验:使用骨髓间充质细胞检测不同配比MgO/PLCL支架的细胞粘附性能;选择合适配比的MgO/PLCL支架,检测MgO/PLCL支架对神经细胞的毒性;检测MgO/PLCL支架对小鼠NSCs增殖的影响;检测MgO/PLCL支架在酸性环境和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）模拟的兴奋性毒性环境中对神经元的保护作用;检测负载PUR、RA的MgO/PLCL支架对NSCs的诱导分化作用。体内试验:制作小鼠T9脊髓半切损伤模型,设置空白对照组（Control组）、PLCL组和MgO/PLCL+PUR/RA组;在术后2周检测脊髓内源性NSCs的激活、迁移和神经元凋亡情况;术后8周检测脊髓胶质瘢痕形成和神经元再生情况;术后3天、4周检测脊髓组织的酸性、碱性离子通道的mRNA表达情况;检测术后小鼠血清Mg2+浓度、肌酐浓度、谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性改变;术后每周通过BMS评分评估小鼠的运动功能恢复情况。[结果]材料制备与表征:制备产物为具备介孔结构的MgO纳米颗粒且具备药物负载能力;各组MgO/PLCL支架均呈取向性排列,随着MgO 比例的增加,纤维表面粗糙度逐渐增加,平均直径逐渐降低,拉伸强度和弹性模量逐渐升高;MgO颗粒改善了支架的亲水性;MgO/PLCL（25:100）和MgO/PLCL（50:100）支架释放Mg2+较快且在2周时达到饱和浓度;MgO/PLCL（25:100）支架可以快速中和pH6.5酸性液体环境,并稳定在pH7.5～pH8.0,且在液体环境中可保持完整的结构特征,所含MgO缓慢匀速降解。体外细胞实验:配比25:100的支架表现出更良好的BMSCs粘附铺展性能并被选择用作后续实验;MgO/PLCL支架具有良好的神经细胞相容性,改善了神经元在pH6.5酸性环境中的生存率;各组支架不影响NSCs的增殖;负载MgO的支架显著减少了 NMDA诱导的神经元钙内流和神经元凋亡;负载PUR/RA的支架促进了 NSCs向神经元方向分化,减少了星形胶质细胞的产生。体内实验:在术后2周,MgO/PLCL+PUR/RA支架促进了脊髓内源性NSCs的激活和迁移,减少了损伤周围的神经元凋亡;在术后8周,MgO/PLCL+PUR/RA支架减少了胶质瘢痕形成,诱导了内源性NSCs在材料边缘和材料内部分化为神经元并发出轴突沿支架生长,促进了小鼠运动功能的恢复;MgO/PLCL+PUR/RA支架不影响脊髓的长期pH环境,且支架中的MgO中和了 PLCL的酸性降解产物;各组支架对小鼠血清Mg2+浓度、肾功能、肝功能均无不良影响。[结论]（1）MgO增加了 MgO/PLCL支架的拉伸弹性模量,改善了纤维的表面粗糙度和亲水性;配比为25:100的MgO/PLCL支架具备良好的Mg2+释放特性,在液体环境中结构稳定,并可快速中和酸性环境。（2）配比为25:100的MgO/PLCL支架更适合细胞的粘附和铺展生长;MgO/PLCL支架对神经细胞具有良好的相容性,在酸性环境和NMDA诱导的细胞兴奋性毒性环境中具有神经保护作用;负载PUR、RA的MgO/PLCL纤维支架促进NSCs向神经元方向分化,减少胶质细胞的产生,引导了轴突沿纤维方向长距离生长。（3）MgO/PLCL+PUR/RA支架抑制了脊髓损伤周围神经元的凋亡,促进了内源性NSCs的激活、迁移和向神经元方向分化,并引导轴突生长,显著减少损伤周围胶质瘢痕的形成,促进了小鼠运动功能的恢复,且具备良好的体内安全性。
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