论文部分内容阅读
自RNA干扰技术(RNAi)发现以来,基于siRNA的药物研究取得了不错的进展,为癌症的基因治疗提供了新思路。然而,裸露的siRNA稳定性差、容易被血清中的核酶降解、血液半衰期短、转染效率低。传统的基因递送系统肿瘤靶向效率低,且不能快速有效地逃逸内涵体,严重限制了siRNA在肿瘤治疗中的应用。聚乙烯亚胺(PEI)是一种具有出色转染效果的金标准聚合物,但其严重的细胞毒性和不可降解性阻碍了其作为基因传递载体的治疗应用。本课题通过向PEI中引入可生物降解的聚乳酸(PLA),合成PEI-PLA共聚物以改善PEI的生物相容性,并在细胞水平验证了其对siRNA的递送效率。低pH插入肽(pH low insertion peptide,pHLIP)是一种pH依赖的具有跨膜活性的可溶性多肽,在弱酸性条件下,pHLIP可作为一种生物纳米注射器,将连接在其碳端的不能进入细胞膜的物质靶向递送至肿瘤细胞内。本课题将酸性微环境下可特异穿膜的pHLIP连接至PEI-PLA共聚物上,设计合成了pHLIP-PEI-PLA共聚物,并在细胞水平验证了其对siRNA的递送效率。本论文主要包括以下两个研究部分:第一部分:将PLA掺入PEI中合成PEI-PLA共聚物,通过静电相互作用络合针对PKM2的siRNA,形成PEI-PLA@siPKM2复合物。通过FTIR、GPC和~1H NMR对递送载体PEI-PLA共聚物进行表征,结果表明我们成功合成了该共聚物。凝胶阻滞实验表明,在N/P比大于7.5时PEI-PLA共聚物可以与siRNA完全络合。血清稳定性实验表明,PEI-PLA@siRNA在10%血清中可以稳定保护siRNA在72 h内不受血清中核酸酶的降解。选用人结肠癌细胞株HCT116、人肝癌细胞株HepG2和人卵巢癌细胞株SKOV3细胞系作为研究对象,通过MTT实验可以发现,PLA的引入明显改善了PEI的生物相容性,降低了其细胞毒性。细胞内化实验、RT-PCR以及Western blot检测证实PEI-PLA共聚物可以将siPKM2有效递送至HCT116、HepG2和SKOV3细胞中,且可在mRNA和蛋白水平有效抑制PKM2的表达。PEI-PLA@siPKM2对于PKM2的敲低效率与商用转染试剂Lipofectamine~?2000相当。第二部分:我们将pHLIP与PEI-PLA共聚物相连接,合成得到pHLIP-PEI-PLA共聚物。GPC和紫外可见吸收光谱分析表明我们成功合成了pHLIP-PEI-PLA共聚物。利用其与针对PKM2的siRNA络合得到pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物。凝胶阻滞实验表明:当N/P比大于7.5时,pHLIP-PEI-PLA共聚物可以与siRNA完全络合。此外,我们通过血清稳定性实验检测了pHLIP-PEI-PLA@siPKM2复合物的稳定性,结果表明pHLIP-PEI-PLA@siRNA复合物在10%和50%血清中可以分别稳定保护siRNA 72 h和12 h不受血清中核酸酶的降解,结果说明pHLIP的引入可以进一步提高PEI-PLA@siRNA递送系统的血清稳定性。DeltaVision Elite高分辨率细胞成像系统和流式细胞仪分析表明:在pH 6.5条件下,pHLIP-PEI-PLA共聚物可以显著提高siPKM2的递送效率。综上所述,我们成功合成了PEI-PLA共聚物和pHLIP-PEI-PLA共聚物,它们均可有效络合siRNA并提高其血清稳定性。细胞实验表明,PEI-PLA和pHLIP-PEI-PLA共聚物均可将siRNA高效递送至肿瘤细胞。在弱酸性条件下(pH 6.5),pHLIP的引入可以显著提高pHLIP-PEI-PLA共聚物对siRNA的递送效率。