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多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) Cp-S316 (GenBank注册号为AY292989)由本实验室从泰山林地土壤中分离获得,该菌株可产生对多种动、植物病原细菌和病原真菌具有较强拮抗作用的环肽类抗细菌活性物质和抗真菌活性物质。并且,在不同的发酵培养基中,抗细菌活性物质和抗真菌活性物质的产量有很大差异。本研究以Cp-S316菌株为出发菌株,通过紫外诱变对抗细菌活性物质高产菌株进行了选育,分离纯化了Cp-S316菌株产生的抗细菌活性物质,研究了活性物质对大肠杆菌的抑制作用。主要研究结果如下。1、运用紫外线诱变以及对自身产生的抗细菌活性物质的抗性筛选法,通过预筛、初筛和复筛,获得多粘类芽孢杆菌Cp-S316突变株A17、E13、E18、E33和F28,其发酵效价分别为出发菌株的191%、167%、163%、160%和162%。A17、E18菌株的高产性能遗传特性稳定。2、Cp-S316菌株发酵液经DK110大孔弱酸性阳离子交换树脂吸附、0.5mol/L的硫酸动态解析,抗细菌活性物质解吸液经旋转蒸发、冷冻干燥以后,进一步经过甲醇抽提,Sephadex G25分子筛层析,得到6个洗脱峰,收集抗细菌活性最高的部分,经CM Sepharose FF离子交换柱层析,0-0.3mol/L的NaCl梯度洗脱得到3个抗细菌活性物质洗脱峰,旋转蒸发浓缩后,进行Sephadex G25分子筛层析脱盐处理,得到抗细菌活性物质的中间纯化物。Cp-S316抗细菌活性物质A组分的最佳制备色谱条件为：流动相为乙腈：水(0.1%TFA)= 23:77 (v/v); Venusil XBP C18柱(250mm×20mm,5μm),流速5 mL/min,柱温30℃,进样量5mL,检测波长为210nm。在此色谱条件下,分离得到保留时间(Rt)为36min(A-1)和51min(A-2)的两个抗细菌活性物质组分；活性物质E组分的最佳制备色谱条件为：流动相为乙腈：水(0.1%TFA)=17:83 (v/v); Venusil XBP C18柱(250mm×20mm,5μm),流速5 mL/min,柱温30℃,进样量5mL,检测波长为210nm。在此色谱条件下,分离得到保留时间(Rt)为17min(E-1)和20min (E-2)的两个抗细菌活性物质组分。E-2、A-2两组分经waters超高效液相色谱工作站检测均显示为单峰,峰形呈正态分布,无杂质峰,初步判断制备成功。3、经试管肉汤二倍稀释法测定,Cp-S316抗细菌活性物对大肠杆菌K12的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)分别为12.5μg/mL和25μg/mL。通过测定大肠杆菌K12菌悬液的OD260的变化,研究了多粘类芽孢杆菌Cp-S316抗细菌活性物质对大肠杆菌K12细胞膜完整性的影响,结果表明Cp-S316抗细菌活性物质可损伤大肠杆菌K12的细胞膜,从而引起胞内RNA、DNA等大分子物质的泄漏。