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结核病是世界上最流行的传染病之一,这很大程度上归咎于耐多药和广泛耐药性结核病的出现以及滞后的结核病基础研究。因此,迫切需要确定新的潜在药物靶标和进一步解析结核病的致病机制来促进抗结核药物的发展。PafA是结核分枝杆菌类泛素蛋白酶体降解系统唯一一个类泛素连接酶。鉴于PafA在人体中没有同源蛋白,并且类泛素蛋白酶体降解系统在绝大多数细菌中也不存在,所以被认为是一个非常有吸引力的药物靶点。然而目前并没有PafA的抑制剂或抑制剂相关机制的研究。此外,作为细胞内蛋白降解系统的关键组成成分,PafA必须经过严格的调控以防止过度的蛋白质降解,而关于PafA体内的调控机制仍然很不清楚。因此在本论文中,我们期望提供一种结核分枝杆菌PafA抑制剂及相关的抑制机制,并基于此发现,通过计算机辅助药物筛选,找到1-2个新型的PafA先导抑制剂。同时基于我们实验室的结核分枝杆菌蛋白质组芯片,鉴定PafA的相互作用蛋白谱并从中挖掘PafA的调控机制。首先,我们发现AEBSF(4-(2-氨乙基)苯磺酰氟盐酸盐)通过结合到丝氨酸119(S119)位显著抑制了结核分枝杆菌PafA的类泛素连接酶活。对S119位点进行模拟AEBSF结合空间位阻的突变研究发现,突变后的PafA蛋白展示出类似于AEBSF抑制的类泛素连接酶活性。结构分析揭示S119位于一个PafA用来结合Pup C-末端的凹槽的关键位点。表型实验证明PafA的S119位对于耻垢分枝杆菌在氮饥饿培养基和巨噬细胞中的生存至关重要。基于PafA S119位的计算机辅助抑制剂筛选研究表明抑制剂PHD-01-58显著抑制PafA的类泛素连接酶活性并且致使结核分枝杆菌对一氧化氮介导的压力环境敏感。另一方面,我们应用结核分枝杆菌蛋白质组芯片系统性的鉴定了PafA的相互作用蛋白谱,筛选出72个PafA的结合蛋白。利用生物信息学分析了候选蛋白质的功能分类。进一步,为了检验取得的PafA相互作用蛋白谱,我们使用BLI相互作用技术手段验证了候选蛋白和PafA的亲和作用。随后在体外执行了相互作用候选蛋白的类泛素连接实验,发现了6个BLI技术验证有相互作用的蛋白中有5个蛋白可以被PafA催化与Pup连接。基于蛋白谱的实验结果,同时结合之前文献报道PafA拥有多个乙酰化修饰位点,我们推测Rv0998作为一个乙酰基转移酶可能对PafA的活性有调控作用。对乙酰化修饰位点进行模拟乙酰化的突变研究发现突变后的PafA蛋白活性受到抑制。表型实验证明PafA的K202位和K361位对于分枝杆菌在氮饥饿培养基中的生存至关重要。结构分析发现K202位和K361位分别位于底物结合区域和Pup结合区域的临近位点。综上所述,本课题发现S119位点可作为一个高效特异的靶点用于抗结核药物的设计,为开发特异性靶向结核分枝杆菌PafA的抑制剂提供清晰的方向。同时我们提供了基于结核分枝杆菌蛋白质组芯片技术鉴定的PafA相互作用蛋白谱以及乙酰化调控PafA酶活的机制,为深入研究类泛素蛋白酶体系统涉及的结核分枝杆菌致病机制提供指引。