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背景:临床上常用的肿瘤学标记物等生化检查手段及影像学检查方法对胰腺癌早期诊断的准确性仍较差。因此,寻找早期诊断的标记物,理解胰腺癌细胞生物学行为,开发新的治疗模式/靶点是目前胰腺癌研究领域的主要方向。胰腺癌有独特的代谢重构现象,与外周组织间发生着基于胰岛素抵抗的代谢交互作用。这不仅导致肿瘤自身代谢改变,还引起全身代谢紊乱,其中葡萄糖耐量异常是首先出现的代谢异常状况,随后发生的外周组织(骨骼肌、脂肪)胰岛素抵抗则与癌瘤增殖、病情进展,癌症恶液质密切相关。外泌体是细胞间物质、信息传递的重要载体,miRNAs则可在转录后水平调控基因表达。miRNAs凭借外泌体的保护避免体液中RNA酶的降解,外泌体则携带miRNAs特异性靶向受体细胞,参与调控基因表达、信号转导,在多种疾病发生发展过程中发挥关键作用。大量研究表明,外泌体miRNAs可作为代谢疾病相关的分子标记物,并可作为治疗靶点来纠正代谢紊乱。因此,本研究旨在通过探索胰腺癌源外泌体是否能导致骨骼肌细胞产生胰岛素抵抗,并以外泌体中miRNAs为靶标,对其生物学功能进行初步检测,从机制层面解释病理现象,以期为开发用以临床的纠正胰腺癌患者代谢紊乱、改进诊疗的潜在干预靶点提供实验依据。方法:KrasLsL-G12D/+,Trp53LSL-R172H/+,Pdx1-Cre(KPC)小鼠是经典的胰腺导管细胞癌动物模型,用其来源的胰腺癌细胞(KPC cells),传代增殖,采用超速离心法从细胞培养上清中提取外泌体(KPC-exosomes),利用外泌体处理分化成熟的小鼠骨骼肌细胞(C2C12 cells),检测骨骼肌细胞摄取葡萄糖的能力、细胞内脂质沉积,及相关信号通路(Insulin&PI3K/Akt&FoxO信号通路)上关键蛋白的表达情况,以验证骨骼肌细胞是否出现胰岛素抵抗。在此前提下,以小鼠胰腺导管上皮细胞(murine pancreatic ductal epithelial cell line,MPDC)所分泌的外泌体(MPDC-exosomes)为阴性对照,利用miRNA基因芯片技术,检测KPC-exosomes中差异表达的miRNAs,并进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析,以验证我们所关注信号通路被相关基因富集情况,其余信号通路信息亦可为后续研究提供思路。利用miRNAs模拟物(miRNA-mimics)及蛋白免疫印迹技术,对表达差异显著的若干miRNAs进行初步验证,观测其对相关信号通路关键蛋白表达的影响,为后续利用人源细胞系、小鼠模型开展转化研究,提供备选对象。结果:外泌体与分化成熟的骨骼肌细胞孵育24小时即可观测到其进入肌管结构(外泌体浓度20μg/ml);胰腺癌源外泌体处理骨骼肌细胞24小时内(外泌体浓度5μg/ml),并不引起后者大量死亡,但足以导致明显的细胞内脂质沉积(外泌体浓度0.2—0.8μg/ml)、葡萄糖摄取能力明显下降(外泌体浓度1μg/ml)、IRS/PI3K/Akt信号轴上关键蛋白表达下调(外泌体浓度0.2—0.8μg/ml);作为Akt下游重要蛋白FoxO1和Glut4,前者在细胞核内发挥转录活性,与骨骼肌胰岛素抵抗、脂质沉积关系密切,后者与骨骼肌细胞摄取葡萄糖直接相关。我们利用小鼠尾静脉注射胰腺癌源外泌体(20μg/只)的方式,借助免疫荧光技术,明确观测到肌肉组织中Fox01核内聚集增多,而Glut4蛋白细胞膜表达明显减少,此结果在细胞实验中亦得到证实;我们进一步对外泌体中的miRNAs进行分析,以MPDC-exosomes为对照,利用miRNA芯片技术,获得KPC-exosomes中差异表达的miRNAs,后续KEGG通路富集分析印证了这批差异表达miRNAs的靶基因主要涉及通路包括Insulin信号通路,PI3K/Akt信号通路,FOXO通路,以及泛素蛋白酶降解途径(ubiquitin proteasome system,UPS);我们对miRNA芯片结果行RT-qPCR验证后,利用免疫印迹技术,检测了 KPC-exosomes中前9个高表达miRNA对胰岛素相关信号通路的影响,发现miR-450b-3p及miR-151-3p可明显下调骨骼肌内IRS1及P110α的表达。结论:本研究结果提示胰腺癌源外泌体,可以导致骨骼肌细胞胞内脂质沉积增多、摄取葡萄糖能力下降,最终促使胰岛素抵抗发生。此病理发展过程与PI3K/Akt/FoxO1信号通路密切相关,而外泌体中miRNAs可能发挥重要作用,有望成为改善胰腺癌诊疗的干预靶点。