茉莉酸信号调控辣椒素类物质生物合成研究

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辣椒素类物质是一种酰胺类生物碱,是辣椒属植物果实特有的次生代谢产物,赋予辣椒独特辛辣味。辣椒素类物质是辣椒属植物为了适应生存环境,在长期进化过程中形成的产物。辣椒素类物质不仅可以保护幼嫩辣椒果实免受病原菌侵染和啮齿类动物取食,而且有着重要的经济价值,其在食品、化工、军事和医药等行业有着广泛应用。作为辣椒果实品质的重要组成部分,辣椒素类物质含量的调控机制是一直是辣椒研究热点。茉莉酸类物质是启动植物防御应答和影响次生代谢产物积累的重要激素。许多植物次生代谢产物可以显著受茉莉酸信号诱导。茉莉酸信号诱导植物次生代谢物形成的机制是保守的,一般是通过转录因子开启一系列生物合成基因的表达,从而影响次生代谢物的形成。本研究发现用茉莉酸甲酯(MeJA)处理可以显著提高辣椒素类物质含量,但是这一过程的分子机制目前尚不清楚。研究茉莉酸信号在辣椒素类物质生物合成中的作用机制,发掘关键调控基因,是对辣椒素类物质代谢进行调控和遗传改良的重要前提。本论文通过生物信息学分析、生理生化和分子生物学等多种实验手段开展相关研究,取得结果如下:(1)利用转录组测序技术对MeJA处理后0h、3h、6h、9h、12h和24h,6个时间点的‘59’号自交系辣椒果实胎座RNA样品进行转录测序测序。测序分析发现:辣椒素合成途径结构基因的表达水平显著受MeJA诱导。利用转录组数据库构建共表达网络,结果发现:15个辣椒素合成关键基因被聚到同一模块。在这一模块中,同时筛选到38个与辣椒素合成基因共表达的转录因子。(2)对和辣椒素合成途径共表达模块的基因进行分析,发现这些转录因子主要是来自于b HLH,ERF,WRKY和R2R3-MYB家族,其中b HLH家族有10个,ERF家族有12个,WRKY家族有8个,R2R3-MYB家族有5个,2个热应激A转录因子(HSFA)和1个TCP转录因子。这些转录因子都显著受茉莉酸信号诱导,并且基本都是在MeJA处理后的3-9小时表达量达到最大值。本论文选取了5个有代表性的转录因子,分别来自b HLH,ERF,WRKY和R2R3-MYB这四个重要的基因家族,用定量PCR进行表达分析。结果发现这5个转录因子受茉莉酸信号诱导的表达模式与转录组数据库得到的结果是一致的。由于ERF和MYB转录因子家族在响应茉莉酸信号调控植物次生代谢形成过程发挥了重要作用,本论文对12个ERF和5个MYB进行了重点分析。结果表明:12个ERF转录因子都具有ERF转录因子特有的保守结构域AP2 DNA结合位点。分析R2R3 MYB转录因子发现:在这5个R2R3-MYB转录因子中,CaMYB108和CaMYB48的在胎座中有具有较高的转录水平,并且它们在不同发育阶段胎座中的表达模式与辣椒素类物质积累时期一致。因此,本论文选取了CaMYB108和CaMYB48进行基因功能验证。(3)CaMYB108响应茉莉酸信号参与辣椒素类物质生物合成和花粉发育。定量PCR分析发现:CaMYB108的表达量受MeJA诱导,并且其表达模式与辣椒素合成途径结构基因的表达模式基本一致。组织表达分析发现:CaMYB108在花蕊和果实胎座中上调表达。序列分析表明CaMYB108具有R2R3 MYB转录因子的典型特征,亚细胞定位实验发现CaMYB108定位于细胞核。病毒诱导基因沉默(VIGS)实验发现CaMYB108导致辣椒素合成途径结构基因的表达量降低,并且导致辣椒素类物质含量急剧下降。CaMYB108沉默植株的花药基本不开裂,并且花粉管萌发率低。瞬时超表达CaMYB108导致辣椒素合成途径结构基因的上调表达,辣椒果实辣椒素类物质的含量上升。酵母单杂交实验结果表明CaMYB108能直接结合辣椒素合成途径结构基因Kas I、AMT和AT3启动子上的MYB结合元件。双荧光素酶报告系统实验证明CaMYB108能激活COMT、BCKDH、BCAT、AMT和Kas I辣椒素合成基因的启动子转录。通过一系列的分子生物学和生化实验,最终证明了CaMYB108参与调控辣椒素类物质的生物合成和花粉发育。(4)CaMYB48编码转录激活因子参与辣椒素类物质生物合成。本研究通过分析‘CM334’、‘ECW’和‘6421’自交系的转录组数据发现:CaMYB48在花后16-30天的果实胎座中有最高的表达量,与辣椒素合成途径结构基因的表达模式以及辣椒素类物质积累模式基本一致。激光共聚焦显微镜观察CaMYB48的亚细胞定位,发现其编码一个核定位信号蛋白。同时在酵母和植物体体内证明CaMYB48具有转录激活的功能,其C端的酸性氨基酸区域对其执行转录激活功能至关重要。VIGS沉默实验降低CaMYB48的表达水平,导致辣椒素合成基因的表达量降低60%-90%不等。在CaMYB48VIGS沉默植株中,辣椒素和二氢辣椒素的含量与对照相比分别降低了43%和45%。通过酵母单杂交、双荧光素酶报告系统和凝胶迁移电泳(EMSA)实验证明:CaMYB48通过直接作用到辣椒素合成基因AT3a和KasIa的启动子上。
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