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肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是引起新生仔猪大肠杆菌性腹泻(Colibacillus diarrhea of newborn piglet)的主要病原之一,该菌的致病前提是通过细菌表面的粘附素与宿主粘膜上皮细胞表面的相应受体结合,从而在该局部组织定居、繁殖、产生毒素或侵入深部损伤或破坏组织,引起疾病或造成隐性感染。目前,该病的防治以药物和疫苗为主,但因药物治疗价格昂贵,而且随着耐药菌株的增多,免疫预防不失为控制该病的最佳选择。因此,本论文利用分子生物学技术在乳酸乳球菌(Lactococcus lactics, L.Lactics)中分泌表达了肠毒素大肠杆菌(ETEC)粘附素主要蛋白亚基FaeG,并将该重组乳酸乳球菌口服免疫ICR小鼠并研究其对ICR小鼠的免疫保护效果和免疫功能的影响,旨在为研发安全、有效的抗大肠杆菌性腹泻的生物制剂提供理论依据。主要研究结果如下：1.肠毒素大肠杆菌(ETEC)粘附素蛋白亚基FaeG在乳酸乳球菌中的分泌表达根据己发表的faeG基因序列设计引物,以标准肠毒素大肠杆菌K88菌株(ETECC83549)DNA为模板,采用PCR扩增获得约0.8 kb的基因片段,通过序列分析证明所获基因片段与Genbank上已登陆的其它faeG基因序列(DQ307495China等)同源性在98%以上,氨基酸序列同源性为99%。将不含信号肽的faeG片段插入乳酸乳球菌分泌型表达载体spNZ8048中,电转化乳酸乳球菌NZ9800,并通过筛选获得重组乳酸乳球菌,命名为L.lactis[spNZ8048-FaeG].重组乳酸乳球菌经nisin诱导培养,SDS-PAGE和Western blot检测显示,重组乳酸菌菌体和菌液上清中目的蛋白的分子量分别为26.0 kDa和23.5 kDa,均与理论分子量相近。说明该蛋白在乳酸乳球菌中可借助表达载体上的信号肽序列,以成熟肽形式分泌表达。2.FaeG重组乳酸乳球菌对ICR小鼠的免疫保护将160只ICR小鼠随机分成4组,分别为PBS组、L.lactis[spNZ8048]组、L.lactis[spNZ8048-faeG]组和L.lactis[spNZ8048-faeG]+L.acidophilus组；每隔两周免疫一次,每次连续三天,共免疫三次。每次免疫后一周间接ELISA法检测小鼠血清中特异性抗体IgG。末次免疫2周后每组取10只小鼠用100×LD50的ETEC C83549(5.34×109cfu／ml)腹腔注射攻毒,记录10d内的小鼠死亡数。结果表明,L.lactis[spNZ8048-faeG]+L.acidophilus组和L.lactis[spNZ8048-faeG]组在首免后第10 d开始产生特异性抗体IgG,且含量逐渐提高,在第35 d达最高。PBS组、L.lactis[spNZ8048]组、L.lactis[spNZ8048-faeG]组和L.lactis[spNZ8048-faeG]+ L.acidophilus组死亡率分别为100%、80%、10%和0%,L.lactis[spNZ8048]组和L.lactis [spNZ8048-faeG]+L. acidophilus组小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)分别为88.9%和100.0%。以上结果说明,口服FaeG重组乳酸乳球菌通过产生特异性抗体使ICR小鼠获得较好的免疫保护效果,且嗜酸乳杆菌具有免疫增强作用。3.FaeG重组乳酸乳球菌对ICR小鼠免疫功能的影响采集四组小鼠样品测定免疫指标以探讨FaeG重组乳酸乳球菌的免疫保护机理,包括小鼠脾脏指数、脾淋巴细胞转化率、外周血T淋巴细胞亚群、小肠固有层IgA+浆细胞数、肠粘液中sIgA含量、血清中IgG、IgM及IgA含量和细胞因子IL-2和IL-10含量。结果显示,口服基因工程乳酸菌可在一定程度上促进小鼠免疫器官发育；显著提高脾淋巴细胞转化率；对外周血T淋巴细胞亚群无显著影响；可刺激肠道粘膜免疫,增加sIgA分泌量；显著提高血清中抗体IgG、IgM、IgA水平及细胞因子IL-2和IL-10含量；同时口服嗜酸乳杆菌可增强小鼠免疫反应。4.FaeG重组乳酸乳球菌对ICR小鼠肠道形态及肠道菌群的影响首次免疫前和末次免疫一周后分别对小鼠进行称重计算增重率；并采集四组小鼠小肠组织,制作电镜切片观察肠道形态；同时收集小鼠回肠内容物对其肠道菌群组成进行分析。结果发现,口服L.lactis[spNZ8048-faeG]工程菌对小鼠生长无显著性影响；显著提高小鼠小肠微绒毛密度,其中L.lactis[spNZ8048-faeG]+L.acidophilus组最大；和PBS组相比,L.lactis[spNZ8048]、L.lactis[spNZ804-faeG]组和L.lactis[spNZ8048-faeG]+L.acidophilus组双歧杆菌和乳杆菌数量显著增加(P<0.05),肠球菌数量显著降低(P<0.05),肠杆菌数量有降低趋势(P>0.05)。以上结果表明,口服乳酸菌,包括基因工程菌可改善小鼠肠道菌群组成。