论文部分内容阅读
研究背景:
胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤,约占全部颅内肿瘤的40%~50%。由于恶性胶质瘤具有侵袭性生长的特性,瘤灶往往与周围脑组织边界不清,尽管现代显微外科技术、放疗、化疗等综合治疗措施已获得巨大的进展,寻找特异性诊断和预后判断的标记物、阐明胶质瘤细胞凋亡的分子机制及寻找治疗靶位点是胶质瘤研究领域亟待解决的基本科学问题。
鞘脂是构成细胞膜的重要结构分子,大量研究表明它们参与细胞的多种病理生理过程,在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥重要作用。鞘氨醇激酶1是维持细胞内鞘脂平衡的重要限速酶,它的主要生化功能是磷酸化鞘氨醇生成1-磷酸鞘氨醇。研究表明SPHK1是一种癌基因,主要存在于细胞浆中。在多种肿瘤中SPHK1的mRNA和蛋白的表达水平都明显升高,在一些肿瘤中还发现SPHK1的表达水平与肿瘤恶性程度、预后等临床病理特征相关。
Akt是蛋白质分子上丝、苏氨酸残基的蛋白激酶,在细胞中介导各种生物学功能,尤其在增强细胞存活能力方面起重要作用。研究已经表明SPHK1可以通过激活PI3K/Akt信号通路从而增强红白血病细胞系HS1细胞的存活能力。
目前已知Akt信号通路的下游直接调控一个非常重要的信号分子——叉头盒转录因子O3a。FoxO3a是一种转录因子,FoxO家族参与调控细胞凋亡、细胞周期及DNA修复等生物学过程。当PI3K/Akt信号通路被激活后可以磷酸化FoxO3a,被磷酸化的FoxO3a在细胞核内与14-3-3蛋白结合并立即被转运出核,导致FoxO3a的转录功能被抑制。相反,抑制Akt的活性,可以导致FoxO3a的去磷酸化、核转位及其调控的靶基因被转录激活。而Bim蛋白是FoxO3a直接转录调控的基因之一。它是Bcl—2家族中的促凋亡蛋白,在细胞凋亡调控过程中起很重要的作用。所以,本文推测SPHK1在胶质瘤中的抗凋亡作用可能是由PI3K/Akt/FoxO3a/Bim信号通路介导的。
第一部分SPHK1基因在人脑胶质瘤中的表达
目的:检测SPHK1在胶质瘤细胞系及胶质瘤组织标本中的表达情况。阐明SPHK1的表达与胶质瘤临床病理特征及生存预后之间的相关性,揭示SPHK1在胶质瘤发生发展过程中的可能意义。
方法:1.应用Western blotting和半定量RT—PCR方法分析比较SPHK1在人正常星形胶质细胞及8株胶质瘤细胞中的表达情况。
2.应用Western blotting和定量RT—PCR方法分析比较SPHK1在来自同一病人的胶质瘤组织(T)和瘤旁非癌脑组织(N)中的表达情况。
3.免疫组化染色检测243例石蜡包埋的胶质瘤组织中SPHK1的表达情况。
4.运用SPSS11.0统计分析软件分析实验结果。卡方检验和Spearman等级相关分析SPHK1的表达与胶质瘤的临床病理特征之间的相关性。Kaplan—Meier法绘制生存曲线并用Log—Rank检验比较生存曲线之间的统计学差异。采用单变量和多变量Cox比例风险模型分析影响生存预后的独立风险因素。P<0.05表示具有统计学意义。
结果:1.与NHA相比,8株胶质瘤细胞系中的SPHK1表达水平有不同程度的升高,而在NHA中几乎没有检测到。
2.相对于瘤旁非癌脑组织,肿瘤组织中的SPHK1的表达水平均明显升高。
3.相对于正常人脑组织切片,WHO分级的所有病理级别的胶质瘤中SPHK1的表达水平呈现不同程度的升高。
4.卡方检验结果表明恶性程度高的胶质瘤患者的SPHK1的表达水平明显高于恶性程度低的胶质瘤患者,随访结束时仍存活的患者的SPHK1表达水平明显低于已死亡的患者。Spearman等级相关系数分析表明SPHK1表达水平与胶质瘤患者的WHO病理分级高度相关,与患者生存时间负相关。Kaplan—Meier生存曲线结果表明SPHK1表达水平高的患者,其生存时间明显低于SPHK1表达水平低的患者。多变量Cox比例风险模型分析表明SPHK1的表达水平是影响患者预后的独立风险因素。
结论:SPHK1在胶质瘤中表达水平升高,并与胶质瘤的病理分级、恶性程度及患者预后相关。
第二部分SPHK1通过Akt/FoxO3a/Bim信号通路增强胶质瘤细胞的抗凋亡能力
目的:建立稳定高表达SPHK1和持续下调SPHK1表达水平的两种胶质瘤细胞系,明确SPHK1在胶质瘤细胞中的抗凋亡作用并阐明其抗凋亡作用的可能分子机制。
方法:1.构建SPHK1基因的逆转录病毒表达质粒pMSCV—puro—SPHK1,与包装质粒pIK用磷酸钙法共转染293FT细胞,制备病毒感染胶质瘤细胞系U87MG和LN—382,嘌呤霉素筛选成功感染的细胞。Western blotting验证是否成功构建了稳定高表达SPHK1的胶质瘤细胞系。
2.构建SPHK1 RNAi质粒pSuper—retro—SPHK1-RNAi1和pSuper—retro—SPHK1-RNAi2,与包装质粒pIK用磷酸钙法共转染293FT细胞,制备病毒感染胶质瘤细胞系U87MG和LN—382,嘌呤霉素筛选成功感染的细胞。Western blotting验证是否成功构建了持续下调SPHK1表达水平的胶质瘤细胞系。
3.将稳定高表达和持续下调SPHK1表达水平的胶质瘤细胞及相应的对照细胞经紫外照射和阿霉素处理后,用trypan blue拒染法、TUNEL及Anexin—Ⅴ结合实验等方法观察改变SPHK1的表达水平对胶质瘤细胞抗凋亡能力的影响。Western blotting检测PARP和caspase—3等凋亡相关蛋白的活性切割片段的变化。
4.Western blotting及定量RT—PCR分别检测稳定高表达和持续下调SPHK1表达的胶质瘤细胞及相应的对照细胞中Bim的蛋白及mRNA表达水平。用免疫组化法检测82例临床胶质瘤石蜡标本中SPHK1和Bim的表达水平,统计学分析两者之间的相关性。
5.Western blotting检测稳定高表达和持续下调SPHK1表达的胶质瘤细胞及相应的对照细胞中FoxO3a、磷酸化FoxO3a、Akt及磷酸化Akt的表达水平。
6.荧光素酶报告基因法分析高表达和持续下调SPHK1表达的胶质瘤细胞及相应的对照细胞中FoxO3a的转录活性。
7.U87MG—SPHK1和LN—382-SPHK1细胞分别经PI3K抑制剂及SPHK1抑制剂处理后,Western blotting检测Akt、磷酸化Akt、FoxO3a、磷酸化FoxO3a及Bim表达水平的改变。
结果:1.成功构建SPHK1基因的逆转录病毒表达质粒pMSCV—puro—SPHK1。成功建立稳定高表达SPHK1的胶质瘤细胞系U87MG—SPHK1和LN—382-SPHK1。
2.成功构建SPHK1 RNAi质粒pSuper—retro—SPHK1-RNAi1和pSuper—retro—SPHK1-RNAi2。成功建立SPHK1表达水平持续下调的胶质瘤细胞系U87MG—SPHK1-RNAi和LN—382-SPHK1-RNAi。
3.相对于对照,稳定高表达SPHK1的胶质瘤细胞的抗凋亡能力显著增强,PARP和caspase—3的活性切割片段减少。SPHK1表达水平持续下调的胶质瘤细胞的抗凋亡能力较对照细胞显著减弱,PARP和caspase—3的活性切割片段增加。
4.相对于对照,稳定高表达SPHK1的胶质瘤细胞中Bim基因的蛋白及mRNA表达水平均降低,而SPHK1表达水平持续下调的胶质瘤细胞中Bim基因的蛋白及mRNA表达水平均升高。82例临床胶质瘤石蜡切片标本中,SPHK1表达水平高的有33例,SPHK1表达水平低的有49例。在33例高水平表达SPHK1的标本中有24例Bim表达下降,而49例低水平表达SPHK1的标本中有34例Bim表达水平升高。Spearman等级相关系数分析表明SPHK1表达程度与Bim表达程度呈负相关。
5.相对于对照,稳定高表达SPHK1的胶质瘤细胞中磷酸化FoxO3a及磷酸化Akt均升高,而SPHK1表达水平持续下调的胶质瘤细胞中磷酸化FoxO3a及磷酸化Akt均减少。
6.相对于对照,稳定高表达SPHK1的胶质瘤细胞中FoxO3a的转录能力明显降低,而SPHK1表达水平持续下调的胶质瘤细胞中FoxO3a的转录能力明显升高。
7.U87MG—SPHK1和LN—382-SPHK1细胞分别经PI3K抑制剂及SPHK1抑制剂处理后,磷酸化Akt、磷酸化FoxO3a均增加,而Bim的表达减少。
结论:1.SPHK1增强胶质瘤细胞的抗凋亡能力。
2.在胶质瘤细胞中SPHK1表达水平的升高,可以降低促凋亡基因Bim的蛋白和mRNA表达水平。
3.在胶质瘤细胞中SPHK1表达水平的升高,可以增加FoxO3a的磷酸化水平从而降低其转录活性。
4.在胶质瘤细胞中SPHK1是通过激活PI3K/Akt信号通路从而增加FoxO3a的磷酸化水平的。
综上所述,在胶质瘤细胞中,SPHK1引起的细胞抗凋亡能力的增强,是通过激活PI3K/Akt信号通路,进而增加FoxO3a的磷酸化水平。FoxO3a的磷酸化水平升高后其转录活性降低从而使处于其下游的、被其转录调控的促凋亡基因Bim的mRNA和蛋白表达水平降低。