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背景间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)因其具有多向分化潜能、免疫调控能力和内分泌功能等是目前在细胞治疗和再生医学领域有应用前景的干细胞之一。MSCs是由具有不同生物学特性的混合亚群组成,来源比较广泛,包括脂肪、脐带和经血来源的子宫内膜等。MSCs目前可以应用于许多疾病的治疗,如自身免疫性疾病、心血管疾病、骨和软骨再生等。但MSCs长期体外传代扩增后是否仍保能持干细胞的生物学特性,其表面标记是否发生明显改变以及不同来源的MSCs表面标记是否存在差异需进一步探讨。脂肪间充质干细胞(Adiposetissue derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)是MSCs中的一种,同样具有MSCs的诸多生物学特性,当对不同的研究进行比较和将其应用于再生医学与细胞治疗时,混合细胞群有可能会降低研究结果的可比性和针对性。目前大部分体内外的研究均使用未分选MSCs混合细胞群,那么分离纯化各个细胞亚群研究生物学特性,无疑会增强MSCs研究的可比性和应用的针对性,筛选ADMSCs治疗心肌损伤的优势亚群,会提高ADMSCs治疗心肌梗死(Myocardial infraction,MI)的效果。本研究通过探讨不同来源MSCs表面标记的比较和MSCs移植治疗心肌梗死的疗效,旨在为再生医学提供理论依据。目的1.探讨人脐带间充质干细胞(Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UCMSCs)、人脂肪间充质干细胞ADMSCs和人经血源子宫内膜间充质干细胞(Menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MenSCs)之间表面标记的差异及随着传代次数的增加其表面标记的变化。2.评价CD73~+ADMSCs、CD73~-ADMSCs和ADMSCs移植治疗大鼠心肌梗死的疗效,并在体外比较各组细胞心肌分化和细胞因子的分泌的差异,从细胞分化和内分泌因素探讨CD73~+ADMSCs等心肌修复的机制。方法1.运用流式细胞术、免疫荧光法分别检测UCMSCs、ADSCs和MenSCs第3、6、9、12代的表面标记CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD45表达率。2.采用酶消化法分离及培养小鼠脂肪间充质干细胞,利用流式细胞仪分选出CD73~-ADMSCs和CD73~+ADMSCs两个亚群。3.结扎SD大鼠冠状动脉前降支,复制成年SD大鼠心肌梗死模型。4.DAPI标记CD73+ADMSCs、CD73-ADMSCs和ADMSCs后,多点注射到心梗部位,运用多普勒彩超检测假手术组、心肌梗死组、CD73+ADMSCs移植组、CD73-ADMSCs移植组、ADMSCs移植组心梗后1W、2W、3W和4W的左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室舒张末期容积(Left ventricular end-diastolic volume,LVEDV)和左心室收缩末期容积(Left ventricular end-systolic volume,LVESV)。5.运用CD73特异性抑制剂腺苷5’-α,β-亚甲基二磷酸(APCP),抑制CD73活性,体外运用5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza)对CD73~+ADMSCs、CD73~+ADMSCs+APCP,CD73~-ADMSCs和ADMSCs组进行心肌化诱导,通过免疫荧光法和免疫印迹法检测心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达。6.收集体外培养CD73~+ADMSCs、CD73~+ADMSCs+APCP,CD73~-ADMSCs和ADMSCs细胞上清液,用Elisa法检测细胞因子的分泌。结果1.流式细胞术检测显示,人UCMSCs、ADSCs和MenSCs的P3代CD29、CD44、CD73和CD105阳性表达率均在95%以上,CD45阴性表达;P3代MenSCs CD90的表达率为(72.43±0.76%),均低于其在UCMSCs(99.67±0.12%)和ADSCs(99.70±0.15%)表达(P<0.001)。UCMSCs、ADSCs和MenSCs随培养代次的增加表面标记CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD45表达率无显著差异(P>0.05)。免疫荧光法结果与流式细胞术结果一致。2.与假手术组相比,各心肌梗死组在1~4W后LVEF和LVEDV显着下降(P<0.01),LVESV显着增加(P<0.01)。与心肌梗死模型组相比,细胞移植组的LVEF和LVEDV显着增加(P<0.01)。与ADMSCs移植组和CD73~-ADMSCs移植组相比,CD73~+ADMSCs移植组LVEF(第1,2,4W)和LVEDV(第4W)增加(P<0.05)。3.免疫荧光和免疫印迹结果均显示体外诱导ADMSCs向心肌分化,CD73~+ADMSCs组cTnT表达量最高。4.ELISA法检测显示:与CD73~-ADMSCs相比,CD73~+ADMSCs分泌VEGF,TGF-β,SDF-1和HGF增加,TNF-α减少(P<0.01),而bFGF分泌水平无影响(P>0.05)。APCP对CD73活性的抑制导致分泌VEGF(P<0.01),TGF-β(P<0.05),SDF(P<0.05)和HGF(P<0.01)减少,TNF-α分泌增加(P<0.01)对bFGF无影响(P>0.05)。CD73~-ADMSCs中HGF和TGF-β的分泌均低于未分选的ADMSCs。结论1.UCMSCs、ADMSCs和MenSCs随培养代次的增加稳定高表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD45,MenSCs的CD90表达率低于其在UCMSCs和ADMSCs的表达。2.CD73~+ADMSCs改善心功能的能力明显优于CD73~-ADMSCs和ADMSCs混合群,可能与CD73能够促进ADMSCs的心肌分化能力和促进VEGF,TGF-β,SDF-1和HGF的分泌并抑制TNF-α的分泌有关。