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精原干细胞（Spermatogonia Stem Cells,SSCs）是一类能将遗传物质传递给下一代的成体干细胞,且SSCs是精子发生的基础。在家禽业中,种公鸡的弱精症或者无精症严重影响产业经济效益,而SSCs的可塑性和种系传递能力则能很好的解决这一问题。同时,SSCs在制备转基因动物、保护濒危动物技术等领域也发挥着重要作用。但由于从体内获得的SSCs数量少,限制了在这些领域的应用。因此很多团队通过体外培养或诱导分化等方法提高SSCs的形成数量,但是由于对SSCs形成的分子机制缺乏深入的了解,使得SSCs体外培养或诱导体系并不完善。因此需详细探究SSCs的形成机制,寻找优化SSCs体外培养或诱导分化的关键靶点,最终实现SSCs的具体应用。为了详细探究SSCs的形成机制,前期对胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ESCs）、原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）、SSCs三种细胞分别进行了转录组测序和H3K4me2的ChIP-Seq,以期从基因、信号通路和表观遗传修饰等角度筛选调控SSCs形成的关键因子。通过多组学联合分析发现:Wnt信号在SSCs形成过程中被显著富集且激活,TDRD1在SSCs形成过程中显著上调且受Wnt信号和H3K4me2的联合调控,因此我们推测:H3K4me2和Wnt信号通路共同调控靶基因TDRD1促进SSCs形成。为了详细研究H3K4me2和Wnt信号通路调控TDRD1在SSCs形成过程中的功能和分子机制,本研究以鸡为实验材料,系统研究了 Wnt信号、H3K4me2修饰协同作用于TDRD1对SSCs形成的影响,并在此基础上利用dCas9-LSD1系统联合ChIP-qPCR和双荧光素酶报告系统等技术系统解析对Wnt信号和H3K4me2与靶基因TDRD1在SSCs的形成过程中的具体调控机制。研究结果如下:（1）基于多组学联合分析确定TDRD1是靶基因前期研究发现激活Wnt-TCF7L2信号或提高H3K4me2水平可促进SSCs形成。为了筛选Wnt信号和H3K4me2调节SSCs形成的靶基因,本研究预测了人（Human）、小鼠（Mouse）、大鼠（Rat）中Wnt信号通路转录因子TCF7L2下游靶基因并进行VENN分析获得7372个保守的Wnt信号靶基因,与转录组数据联合分析发现:1558个靶基因在SSCs形成过程中差异表达,其中140个靶基因参与SSCs形成过程,且仅有18个基因受组蛋白甲基化修饰。通过文献检索和差异表达分析确定TDRD1可能为调控SSCs的形成的关键基因。为此对其进行了功能分析。将TDRD1的过表达和干扰载体通过鸡胚钝端注射方法注射至鸡胚,并收集发育至18.5d的鸡胚睾丸,通过免疫组化检测发现与Blank（237.00±3.00）组相比,干扰TDRD1（205.00±5.00）显著降低睾丸中SSCs形成数量（P＜0.05）,而过表达TDRD1（330.50±10.50）则显著增加SSCs的形成数量（P＜0.05）;HE染色结果发现Blank组睾丸曲精细管结构完整,注射OETDRD1组的睾丸组织结构完整,SSCs数量增多,而注射shTDRD1组的睾丸组织结构松散,SSCs数量减少,说明TDRD1能促进SSCs的形成。（2）H3K4me2调节TDRD1促进SSCs的形成为了明确H3K4me2修饰对TDRD1表达的影响,本研究在体内外SSCs形成的过程中通过分别干扰LSD1和MLL2的方式改变H3K4me2修饰水平后,利用qRT-PCR检测了 TDRD1的表达水平,结果显示在体内外诱导ESCs形成SSCs的过程中,与对照组相比,干扰LSD1后,TDRD1基因表达量显著上调（P＜0.05）,而干扰MLL2后,TDRD1基因表达虽出现下调但差异不显著。但是Western blot检测发现H3K4me2水平上升后,TDRD1蛋白表达量极显著上调（P＜0.01）,H3K4me2修饰水平降低后,TDRD1蛋白表达极显著下调（P＜0.01）。为了研究H3K4me2是否影响TDRD1调节SSCs的形成过程,本研究在体外SSCs诱导过程中发现:形态学观察发现在正常的RA诱导过程中12d出现类SSCs,并聚团成葡萄串状克隆,而与对照组相比,同时干扰TDRD1和LSD1并不影响SSCs的形成,但是同时干扰TDRD1和MLL2不仅延缓了类胚体的形成,且无类SSCs克隆形成;qRT-PCR结果表明在体外ESCs诱导形成类SSCs的过程中H3K4me2升高同时可以挽救TDRD1水平的降低,且SSCs标记基因Integrinβ1的表达量也上升;流式细胞分析结果表明:与单独干扰TDRD1（6.71±0.755）的诱导过程相比,同时干扰TDRD1和LSD1后SSCs的生殖标记蛋白Integrin β1 阳性率（21.90±1.005）极显著升高（P＜0.01）,而同时干扰TDRD1和MLL2后Integrin β1阳性率（2.77±0.595）并未发生显著的变化（P＞0.05）。间接免疫荧光检测结果与流式细胞分析结果基本一致。在体内SSCs形成过程中,qRT-PCR结果发现:与单独干扰TDRD1相比,同时干扰LSD1和TDRD1后TDRD1和Integrin β1的表达显著升高（P＜0.05）,而同时干扰MLL2和TDRD1后TDRD1的表达显著降低（P＜0.01）,Integrinβ1的表达未发生显著变化（P＞0.05）;流式细胞分析和免疫组化结果与qRT-PCR结果基本一致。综上:H3K4me2调控TDRD1促进SSCs的形成。（3）H3K4me2通过降低TCF7L2在TDRD1启动子区的富集水平来调控TDRD1的转录为了解析SSCs形成过程中H3K4me2调控TDRD1表达的分子机制,本研究通过ChIP-qPCR检测发现H3K4me2在TDRD1启动子-800-0bp区域富集且在SSCs中富集水平极显著高于ESCs（P＜0.01）,双荧光素酶检测发现H3K4me2正向调控TDRD1的转录。为了精确的调节TDRD1启动子区域的H3K4me2水平,本研究通过构建靶向TDRD1启动子区域的dCas9-LSD1打靶载体,并通过ChIP-qPCR检测发现dCas9-LSD1-P1、dCas9-LSD1-P2、dCas9-LSD1-P3、dCas9-LSD1-P4 可以靶向 TDRD1不同启动子区域并显著降低该区域的H3K4me2水平（P＜0.05）,表明打靶载体构建成功,且具有靶向能力。进一步双荧光素酶结果发现dCas9-LSD1-P1、dCas9-LSD1-P2、dCas9-LSD1-P3、dCas9-LSD1-P4可以显著降低TDRD1启动活性。前期研究发现TCF7L2结合在TDRD1启动子-161-0 bp区域。为了确定影响TCF 7L2与TDRD1启动子结合的H3K4me2修饰的具体区域,通过ChIP-qPCR结果发现dCas9-LSD1-P1、dCas9-LSD1-P2、dCas9-LSD1-P3、dCas9-LSD1-P4 可以降低 TCF7L2 在 TDRD1 启动子区的富集水平,但dCas9-LSD1-P4对其结合情况影响不显著,表明主要是TDRD1启动子P1、P2、P3区域H3K4me2修饰水平的降低导致TCF7L2在TDRD1启动子区域的富集水平的降低。为了验证H3K4me2联合TCF7L2对TDRD1转录水平的影响,将dCas9-LSD1-P1、dCas9-LSD1-P2、dCas9-LSD1-P3、dCas9-LSD1-P4 与 OETCF7L2 共转,双荧光素酶实验发现与单独转染OETCF7L2相比,同时转染dCas9-LSD1-P1/P2/P3和OETCF7L2后TDRD1转录水平极显著的降低,而同时转染dCas9-LSD1-P4和OETCF7L2后TDRD1转录水平变化不显著,表明TDRD1启动子P1、P2、P3区域的H3K4me2修饰联合TCF7L2影响TDRD1的转录。综上,TDRD1启动子P1、P2、P3区域的H3K4me2修饰可以通过降低TCF7L2在TDRD1启动子区的富集水平来调控TDRD1的转录。本研究详细探究了 Wnt信号和H3K4me2与靶基因TDRD1在SSCs的形成过程中的具体调控机制,丰富了调节SSCs形成的调控网络,为实现SSCs的具体应用提供理论方案。