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肾脏纤维化作为慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD)的常见病理特征主要表现为肾小球硬化和肾小管间质纤维化。肾脏纤维化的进程可引起功能性肾实质的持续性损失,最终导致终末期肾病。肾小管上皮细胞功能损伤是引起肾脏纤维化的众多病因之一。II型上皮间质转分化理论认为损伤的上皮细胞能够成为肌纤维母细胞直接前体。尽管该理论存在一定争议,但病理条件下,肾小管上皮细胞发生转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)表达升高,细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白合成增加等变化,确实能够参与肾间质纤维化的发展进程。许多蛋白、细胞因子及生长因子均参与了肾间质纤维化的形成。越来越多的证据表明血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)是肾素血管紧张素系统(rennin angiotensin system, RAS)中最重要的活性成分。在病理生理条件下,Ang Ⅱ水平升高能够引起炎症及纤维化反应。Ang Ⅱ是包括梗阻性肾病等多种肾脏病情况下导致肾间质纤维化的主要病理媒介。多项研究证实,抑制肾脏局部R,AS能够减缓单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型诱导的促纤维化反应。Janus激酶(Janus kinase, JAK)家族/信号转导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)是细胞内重要的信号转导通路,参与多种细胞因子与生长因子的表达调控过程。JAK2/STAT3也是Ang Ⅱ下游研究较多的信号通路之一。STAT3对促进细胞周期及防止细胞凋亡具有十分重要的作用。近年来逐渐发现STAT3能够介导肾脏纤维化的发生,尤其是在梗阻性肾病中。目前已有研究报道Ang Ⅱ或STAT3参与了肾损伤的发生,但Ang Ⅱ/STAT3通路与肾脏纤维化的直接关系还尚不明确。STAT3的激活需705位酪氨酸tyrosine 705, Tyr705)及727位色氨酸(serine 727, Ser727)的磷酸化,而其685位赖氨酸(lysine 685, Lys685)能够进行可逆的乙酰化。STAT3这一氨基酸位点的乙酰化受到组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase, HAT)环磷酸腺苷反应元件结合因子(cAMP response element binding protein-binding protein, CBP)/p300以及组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)的调控,并且与STAT3二聚体的形成及转录调控活性密切相关。转录激活辅因子p300及其同源的CBP能够通过其底物和下游的辅激活因子如STAT3,调控多种细胞活动。另外,有大量证据显示p300能够促进纤粘连蛋白(fibronectin)的沉积,而fibronectin则是ECM标志分子,与细胞粘附及纤维化密切相关。SIRT1 (silent mating type information regulation 2 homolog 1)是研究较多的催化STAT3去乙酰化的HDAC之一。SIRT1是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotid, NAD+)依赖的III类HDAC,烟酰胺(nicotinamide, NIC)能够抑制其活性。具有肾脏保护作用的天然多酚白藜芦醇(resveratrol)可激活SIRT1从而使STAT3 Lys685去乙酰化。Resveratrol的肾脏保护作用与Smad3, p53及NF-KB(p65)等通路有关,然而抑制STAT3乙酰化是否与resveratrol的抗纤维化作用有关还有待证实。本研究观察了STAT3乙酰化与磷酸化在AngⅡ引起的肾小管上皮细胞促纤维化反应及UUO引起的肾脏纤维化中的相互关系,进而从离体及整体上揭示STAT3信号通路在肾脏纤维化发展进程中的作用。实验共分为三个部分：一、STAT3的激活在AngⅡ引起的肾小管上皮细胞促纤维化反应中的作用1. Ang Ⅱ引起肾小管上皮细胞促纤维化反应Western blot结果显示,Ang Ⅱ处理肾小管上皮细胞NRK-52E 48 h后,fibronectin, Ⅳ型胶原蛋白(collagen Ⅳ),α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)水平显著升高,并呈剂量依赖关系。1 μM Ang Ⅱ能够显著升高这些促纤维化因子的表达。2. Ang Ⅱ引起肾小管上皮细胞中STAT3的激活Western blot结果显示,Ang Ⅱ处理能够激活NRK-52E肾小管上皮细胞中JAK2/STAT3信号通路。AngⅡ处理30 min后JAK2磷酸化上调,而STAT3 Tyr705的磷酸化也显著升高,峰值为60 min。Ang Ⅱ对NRK-52E细胞中的STAT3 Ser727磷酸化及STAT3 Lys685乙酰化基础水平没有影响。3.姜黄素(Curcumin, Cur)抑制肾小管上皮细胞中STAT3乙酰化及磷酸化本实验中使用p300及JAK2的抑制剂Curcumin观察JAK2/STAT3信号通路是否参与了AngⅡ引起的促纤维化反应。Western blot结果显示,用curcumin (12.5 μM)预处理细胞60 min能够降低STAT3乙酰化水平,并抑制AngⅡ引起的STAT3Tyr705磷酸化水平升高。4. Curcumin抑制AngⅡ引起的肾小管上皮细胞促纤维化反应Western blot结果显示,curcumin (12.5 μM)预处理细胞60 min还能够降低AngⅡ刺激48 h导致的fibronectin, collagen Ⅳ及TGF-β1表达上调。这部分的实验结果说明STAT3参与了Ang Ⅱ所引起的肾小管上皮细胞促纤维化反应。二、STAT3 Lys685乙酰化与STAT3 Tyr705磷酸化在AngⅡ引起的肾小管上皮细胞促纤维化反应中的作用1.抑制STAT3 Lys685乙酰化能够降低Ang Ⅱ引起的肾小管上皮细胞STAT3 Tyr705磷酸化水平升高Western blot结果显示,SIRT1激动剂Resveratrol (12.5μM)或p300 siRNA (50 nM)预处理细胞60 min均能够降低STAT3 Lys685乙酰化水平并阻断Ang Ⅱ刺激60 min引起的STAT3 Tyr705磷酸化水平升高,但对STAT3 Ser727的磷酸化没有影响。而细胞免疫荧光显示,用p300的选择性抑制剂C646 (10 μM)预处理细胞60 min能够显著减少Ang Ⅱ刺激60 min引起的与Tyr705磷酸化水平成正比的STAT3核转移。2.抑制STAT3 Lys685乙酰化能够减弱Ang Ⅱ引起的肾小管上皮细胞促纤维化反应Western blot结果显示,Resveratrol (12.5 μM)或C646(10μM)预处理细胞60min均能够缓解Ang Ⅱ刺激48 h导致的肾小管上皮细胞中fibronectin, collagen Ⅳ, TGF-β1及α-SMA表达上调。3.抑制Ang Ⅱ引起的肾小管上皮细胞STAT3 Tyr705磷酸化对STAT3 Lys685没有影响Western blot结果显示,酪氨酸激酶JAK2的抑制剂AG490 (12.5 μM)预处理细胞60 min降低了Ang Ⅱ刺激60 min引起的STAT3 Tyr705磷酸化,但对STAT3 Ser727磷酸化及STAT3 Lys685没有影响。4.抑制肾小管上皮细胞STAT3 Tyr705磷酸化能够减弱Ang Ⅱ引起的肾小管上皮细胞促纤维化反应Western blot结果显示,细胞给予AG490 (12.5 μM)预处理60 min后,能够阻断Ang Ⅱ刺激48h引起的肾小管上皮细胞fibronectin表达上调。5.上调肾小管上皮细胞STAT3乙酰化能够升高STAT3磷酸化水平,并引起下游促纤维化反应5.1 Nicotinamide引起肾小管上皮细胞STAT3激活并引起促纤维化反应Western blot结果显示,SIRT抑制剂nicotinamide处理细胞48 h能够显著升高肾NRK-52E细胞STAT3 Lys685乙酰化和STAT3 Tyr705磷酸化水平,同时伴随fibronectin、collagen Ⅳ表达升高,并且成剂量依赖趋势。5.2过表达p300引起肾小管上皮细胞STAT3激活并导致促纤维化反应Western blot结果显示,通过转染重组质粒过表达p30048 h显著升高了NRK-52E细胞的p300蛋白水平,并伴随STAT3 Lys685乙酰化和STAT3 Tyr705磷酸化水平的升高。另外,过表达p30048 h还能够上调fibronectin, collagen Ⅳ以及TGF-β1蛋白水平。这部分的实验结果说明抑制STAT3 Lys685乙酰化与降低AngⅡ引起的肾小管上皮细胞中STAT3 Tyr705磷酸化及STAT3介导的促纤维化反应密切相关。STAT3 Tyr705磷酸化是AngⅡ引起的肾小管上皮细胞促纤维化反应所必须的。上调肾小管上皮细胞STAT3乙酰化水平能够上调STAT3磷酸化并引起下游促纤维化反应。三、Resveratrol抑制UUO肾脏中STAT3的乙酰化、磷酸化及肾脏纤维化1.UUO引起了肾脏STAT3的激活和促纤维化反应Western blot结果显示,在小鼠UUO模型中,手术一天后肾脏STAT3 Tyr705磷酸化显著升高,但STAT3 Lys685乙酰化水平并没有明显变化。纤维化相关基因fibronectin, collagen Ⅳ及α-SMA在UUO小鼠中显著升高,从手术后三天开始表现出统计学差异,并持续到实验终止(7天)。2. Resveratrol抑制UUO引起的梗阻肾脏中STAT3的激活以及促纤维化基因的高表达Western blot结果显示,通过灌胃术给予UUO小鼠resveratrol (100mg/kg)处理能够降低STAT3 Lys685乙酰化水平,并缓解UUO所引起的STAT3 Tyr705磷酸化水平升高(1天)。Resveratrol灌胃3天能够抑制UUO引起的梗阻性肾脏中fibronectin, collagen Ⅳ和α-SMA蛋白水平的升高。3. Resveratrol缓解UUO肾脏小管间质纤维化马松染色(masson staining)及苏木精-伊红染色(HE staining, hematoxylin-eosin staining)显示了resveratrol处理后梗阻性肾脏的组织学变化。在正常与假手术的小鼠肾脏中,没有显著的肾间质纤维化发生,也没有可见的胶原染色。梗阻三天的肾脏表现出小管间质纤维化和蓝色的胶原沉积染色。UUO给予resveratrol治疗组小鼠的肾小管间质纤维化和胶原沉积与UUO组相比显著减少。这部分实验结果与离体细胞实验结果一致,提示STAT3乙酰化参与了梗阻性肾病的纤维化进程。综上所述,本课题的研究结果显示AngⅡ能够通过激活JAK2引起肾小管上皮细胞STAT3 Tyr705磷酸化水平的升高,并进一步导致fibronectin, collagen Ⅳ, a-SMA的表达上调；抑制STAT3 Lys685乙酰化可抑制Ang Ⅱ引起的STAT3 Tyr705磷酸化水平升高及纤维化相关基因fibronectin, collagen Ⅳ, TGF-β1, α-SMA的表达上调；抑制STAT3 Tyr705磷酸化能够抑制Ang Ⅱ引起的肾小管上皮细胞fibronectin表达上调,但不影响STAT3 Lys685乙酰化水平；上调STAT3Lys685乙酰化水平能够同时上调STAT3 Tyr705磷酸化水平并诱导下游的纤维化相关基因fibronectin, collagen Ⅳ, TGF-β1的表达上调。另外,在整体上给予SIRT1激动剂resveratrol可以降低STAT3 Lys685乙酰化并缓解UUO小鼠STAT3 Tyr705磷酸化升高及纤维化相关基因fibronectin, collagen Ⅳ, α-SMA的表达上调。HE染色和马松染色结果显示resveratrol可有效缓解UUO引起的肾间质纤维化。以上这些结果提示STAT3乙酰化对于STAT3信号通路所介导的肾脏纤维化是不可或缺的。