亨廷顿病(Huntington’s Disease,HD)是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病,由编码亨廷顿蛋白(huntingtin,Htt)的HD基因第一外显子中CAG重复序列异常扩增所致。突变HD基因编码的突变Htt其氨基末端含有异常扩展的谷氨酰胺重复序列(polyglutamine,Poly Q),在细胞内错误折叠形成不溶性聚集物(aggregates),可通过多种途径产生细胞毒性,在HD发病中具有重要作用。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内清除错误折叠蛋白的主要降解途径。UPS在降解错误折叠蛋白过程中,需首先将底物泛素化。泛素连接酶(ubiquitin ligase) E3通过特异性识别底物,介导活化的泛素从泛素结合酶(ubiquitin conjugating enzyme) E2转移到底物活化的赖氨酸(Lys)残基,是泛素化过程的关键酶之一。底物蛋白上的赖氨酸残基可进行多聚泛素化(polyubiquitination)修饰。泛素本身具有7个Lys残基(6、11、27、29、33、48和63位),泛素之间通过其中一种或多种连接方式首尾相连形成多聚泛素化链。在7种泛素连接形式中,以Lys-48和Lys-63方式连接最为常见,其中Lys-48多聚泛素化链的形成称为典型泛素化修饰,介导UPS降解,其他赖氨酸位点多聚泛素化链的形成称为非典型的泛素化修饰,不能介导UPS降解,反而抑制典型泛素化修饰介导的UPS降解。非典型的泛素化修饰以Lys-63多聚泛素化链最常见。细胞内有数以千计的蛋白泛素化过程在进行,这种对特定蛋白高度特异的降解机制主要由E3决定。E3主要有HECT (homologous to E6AP C terminus)结构域家族、RING-finger结构域家族和U-box结构域家族,其中HECT家族E3自身具有延长多聚泛素化链作用。根据N-末端氨基酸序列的不同,HECT家族可分为3个亚家族：含有RLDs(RCC1-likedomains)结构域的HECT E3(HERC)、含有WW结构域的HECT E3(Nedd4/Nedd4-like E3)以及不含有RLDs和WW结构域的HECT E3(SI-HECT E3)。含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WW domain-containing E3ubiquitin protein ligase1, WWP1)是HECT结构域家族中的一种E3,由C2-WW-HECT结构域构成,中间的4个WW结构域可识别底物中富含脯氨酸的区域(proline-rich region, PRR),决定底物结合特异性；C-末端的HECT结构域为活性区域,决定多聚泛素化链的连接形式,对不同的底物,进行不同形式的泛素化修饰,包括单泛素化、Lys-48及Lys-63多聚泛素化等形式。WWP1能对多种神经退行性疾病的致病蛋白进行多聚泛素化修饰,在多聚谷氨酰胺神经退行疾病齿状核红核苍白球路易体萎缩症(dentatorubral-pallidoluysianatrophy, DRPLA)中,WWP1可通过WW结构域与atrophin-1中Poly Q序列相互作用而对其进行多聚泛素化修饰。Htt氨基末端中既含有PRR,也含有Poly Q序列,因此,WWP1可能通过其WW结构域与Htt中的PPR和/或Poly Q序列相互作用而对其进行泛素化修饰。突变Htt能在转录水平影响包括UBR1、UBE3B等E3泛素连接酶基因在内的多种基因的表达,也可能对WWP1的表达产生影响,并因此影响对自身的泛素化修饰和降解,导致相应的病理学损害。WWP1能否对突变Htt进行泛素化修饰以及在HD脑内其表达水平是否有所改变,目前未见报道。为了证明以上假设,本研究检测了WWP1对突变Htt泛素化、降解和毒性的影响,分析了WWP1对突变Htt泛素化修饰的形式,并观察了突变Htt对WWPl表达的影响。1.WWP1与突变亨廷顿蛋白聚集物共定位为了分析WWP1与突变Htt相互作用的可能性,首先观察了表达突变Htt的N2a细胞中内源性和转染表达的WWP1与突变Htt聚集物的共定位关系。免疫荧光染色显示,在转染正常Htt(Htt20Q)的N2a细胞中,内源性WWP1与转染表达的Htt20Q均弥散分布于细胞质内；在转染突变Htt(Htt160Q)的N2a细胞中,部分Htt聚集物内可见WWPl聚集。在共转染Htt160Q和WWP1的N2a细胞中,也可见聚集的WWP1与部分突变Htt聚集物共定位。对HD转基因小鼠R6/2小鼠脑组织进行滤过陷阱分析发现,WWP1能与突变Htt聚集物结合。由此提示,WWP1可能与突变Htt具有相互作用。2.WWP1促进突变亨廷顿蛋白的泛素化修饰为了明确WWP1作为一种E3能否对突变Htt进行泛素化修饰,将表达突变Htt的N2a细胞过表达或沉默WWP1后进行免疫沉淀分析,发现在抑制蛋白经蛋白酶体途径降解的条件下,过表达WWP1使突变Htt的泛素化水平升高,沉默WWPl使其泛素化水平降低；而当过表达活性位点突变(将WWP1第886位的半胱氨酸突变为丝氨酸)的WWPl时,其介导突变Htt泛素化修饰的作用丧失。由此表明,WWP1能对突变Htt进行泛素化修饰。3.WWP1抑制突变亨廷顿蛋白的降解并增强其细胞毒性为了分析WWP1对突变Htt的泛素化修饰在突变Htt经UPS途径降解中的作用,检测了WWP1对突变Htt稳定性的影响。免疫印迹分析显示,在表达突变Htt的N2a细胞中,过表达WWP1使聚集型和非聚集型突变Htt蛋白水平明显升高,沉默WWP1则使其明显降低。在荧光显微镜下对聚集物进行计数分析证明,过表达WWP1使聚集物明显增加,沉默WWP1可显著减少聚集物。对表达突变Htt的N2a细胞中突变Htt聚集物进行滤过陷阱分析表明,过表达WWP1可明显升高突变Htt聚集物水平,沉默WWP1则相反。RT-PCR检测表明,无论是过表达WWP1还是沉默WWP1,对突变Htt的表达无影响,因此,WWP1对突变Htt的泛素化修饰增强了突变Htt的稳定性。台盼蓝染色显示,在表达突变Htt的N2a细胞中增加WWP1可显著增加突变Htt细胞毒性,减少WWP1可明显抑制其毒性。4.WWP1抑制突变亨廷顿蛋白的泛素-蛋白酶体途径降解为了明确WWP1介导的突变Htt泛素化修饰对突变Htt稳定性的增强是否由其对蛋白酶体降解途径抑制所致,观察了抑制蛋白酶体活性对沉默WWP1增强突变Htt降解作用的影响。表达突变Htt的N2a细胞中,利用放线菌酮(Chlorhexidine Dihydrochloride,CHX)阻断蛋白合成,在加入CHX不同时间点观察WWPl对突变Htt降解的影响。免疫印迹分析显示,沉默WWP1可促进突变Htt降解,时间越长,其降解幅度越大。当用蛋白酶体活性抑制剂MG132处理后,沉默WWP1促进突变Htt降解的作用被阻断。由此说明,WWP1介导的突变Htt泛素化修饰对突变Htt经蛋白酶体途径的降解具有抑制作用。5.WWP1对突变亨廷顿蛋白进行Lys-63式泛素化修饰WWP1对突变Htt的泛素化修饰抑制其泛素-蛋白酶体途径的降解提示,WWP1可能对突变Htt进行非典型泛素化修饰。为了证明这一假设,首先根据泛素上7个不同赖氨酸位点构建了7个泛素的突变质粒,在表达突变Htt的N2a细胞中,观察不同突变位点的泛素对WWP1介导突变Htt泛素化水平的影响。免疫沉淀分析发现,过表达野生型WWP1,其介导的突变Htt泛素化水平升高,但在转染泛素上63位赖氨酸位点突变质粒的细胞中,突变Htt的泛素化水平明显低于过表达野生型WWP1的细胞,与未过表达野生型WWP1的细胞相似；在转染其他6个赖氨酸位点突变质粒的细胞中,突变Htt的泛素化水平与过表达野生型WWP1的细胞相似。由此说明,WWP1介导泛素以63位赖氨酸位点连接形成多聚泛素化链,即WWP1以Lys-63方式对突变Htt进行非典型泛素化修饰,该泛素化修饰形式不能介导突变Htt被蛋白酶体识别并降解。6.突变亨廷顿蛋白上调WWP1表达突变Htt能在转录水平影响包括E3泛素连接酶基因在内的多种基因的表达,为了明确突变Htt是否通过影响WWP1的表达而影响UPS对自身的降解,对R6/2小鼠和表达突变Htt的N2a细胞中WWP1表达水平进行了检测,结果表明,突变Htt能在转录水平上调WWP1的表达。在R6/2小鼠脑内,WWP1蛋白水平较野生型小鼠明显升高；在转染表达Htt160Q的细胞内,与转染表达Htt20Q的细胞比较,转染后48h的WWP1蛋白水平无明显变化,72h明显升高。用RT-PCR对WWP1的mRNA水平检测发现,转染表达Htt160Q的N2a细胞内WWP1mRNA水平在转染后48h无变化,但在转染72h后较转染表达Htt20Q的N2a细胞升高。结论：泛素连接酶WWP1可通过Lys-63方式对突变Htt进行非典型泛素化修饰并由此抑制突变Htt经泛素蛋白酶体途径的降解,产生细胞毒性；突变Htt的细胞毒性可能部分与其通过上调WWP1的表达而促进自身的非典型泛素化修饰,抑制其泛素蛋白酶体途径的降解,在细胞内大量累积有关；WWP1可作为调节突变Htt降解、探索治疗HD的靶点。