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第一部分神经病理性疼痛中脊髓小胶质细胞极化状态的变化情况及其对疼痛行为学的影响目的观测神经病理性疼痛大鼠脊髓小胶质细胞极化状态的变化情况及其对疼痛行为学影响(1)观测SNL神经损伤致神经病理性疼痛大鼠的疼痛行为学及其脊髓小胶质细胞的极化状态变化情况;(2)观测STZ致糖尿病性神经痛大鼠的疼痛行为学及其脊髓小胶质细胞的极化状态变化情况;(3)离体实验中,观测LPS、IL-4刺激诱导BV2小胶质细胞极化状态的变化情况;(4)离体实验中,观测LPS、IL-4刺激诱导原代小胶质细胞极化状态的变化情况;(5)鞘内注入经LPS、IL-4孵育的原代小胶质细胞,观测大鼠疼痛行为学的变化。方法(1)观测SNL神经损伤致神经病理性疼痛大鼠的疼痛行为学及其脊髓小胶质细胞的极化状态变化情况选取6只大鼠行SNL术,术后用von Frey纤维丝以up-down法推算大鼠的机械缩足痛阈值(PWT)两周,观测SNL神经损伤致神经病理性疼痛大鼠的行为学;另取18只大鼠随机分为3组(n=6):分别为对照组、假手术组和SNL组。在术后第7天,急性分离脊髓腰膨大处的小胶质细胞,行流式细胞学检测,评估SNL大鼠脊髓小胶质细胞极化平衡的变化情况。(2)观测STZ致糖尿病性神经痛大鼠的疼痛行为学及其脊髓小胶质细胞的极化状态变化情况选取6只大鼠腹腔注射STZ,术后定期测定大鼠血糖,并以von Frey纤维丝以up-down法推算大鼠的机械缩足痛阈值(PWT),为期4周,并设置相应对照组,观测STZ致糖尿病性神经痛大鼠的行为学;另取12只大鼠随机分为2组(n=6):分别为对照组、STZ组。在术后第14天,急性分离腰膨大处脊髓中的小胶质细胞,行流式细胞学检测,评估STZ大鼠脊髓小胶质细胞极化状态的变化情况。(3)离体实验中,观测LPS、IL-4刺激诱导BV2小胶质细胞极化状态变化情况分别用LPS(1mg/ml)、IL-4(20μg/ml)孵育BV2小胶质细胞24小时。实验细胞分为对照组、LPS组和IL-4组。以Western Blot测定各组细胞中M1型小胶质细胞标记蛋白i NOS和M2型小胶质细胞标记蛋白Arg的蛋白表达情况;以流式细胞术测定各组细胞中M1型小胶质细胞标记蛋白CD86和M2型小胶质细胞标记蛋白CD206的蛋白表达情况;以免疫荧光共聚焦测定各组细胞中M1型小胶质细胞标记蛋白i NOS和M2型小胶质细胞标记蛋白Arg的蛋白荧光强度。(4)离体实验中,观测LPS、IL-4刺激诱导原代小胶质细胞极化状态变化情况分别用LPS(1mg/ml)、IL-4(20μg/ml)孵育BV2小胶质细胞24小时。实验细胞分为对照组、LPS组和IL-4组。以Western Blot测定各组细胞中M1型小胶质细胞标记蛋白i NOS和M2型小胶质细胞标记蛋白CD206的蛋白表达情况以免疫荧光共聚焦测定各组细胞中M1型小胶质细胞标记蛋白CD86和M2型小胶质细胞标记蛋白Arg的蛋白荧光强度。(5)鞘内注入经LPS、IL-4孵育的原代小胶质细胞,观测大鼠疼痛行为学的变化将经LPS诱导的以M1型为主的原代小胶质细胞和经IL-4诱导的以M2型为主的原代小胶质细胞分别鞘内注射入正常大鼠体内,用von Frey纤维丝以up-down法推算大鼠的机械缩足痛阈值(PWT),观测大鼠疼痛行为学的变化情况;将经LPS诱导的以M1型为主的原代小胶质细胞和经IL-4诱导的以M2型为主的原代小胶质细胞分别鞘内注射入神经病理性疼痛大鼠体内,用von Frey纤维丝以up-down法推算大鼠的机械缩足痛阈值(PWT),观测大鼠疼痛行为学的变化情况。结果(1)SNL组大鼠手术同侧后肢50%PWT较基础值进行性下降,术后第一天即下降至基础水平的43%,(p<0.01),术后第3天达到低水平(18%,p<0.01),以后在整个观察期间均维持在该水平。而术后第7天,SNL组大鼠手术同侧脊髓腰膨大处小胶质细胞中M1型标记蛋白CD86较假手术组、对照组明显升高(p<0.01)。(2)STZ组大鼠注药后血糖进行性升高,术后三天达到高值,且在整个观察期间均维持在该高水平(p<0.01)。同时,STZ组大鼠体重较对照组增长明显缓慢(p<0.01),后肢50%PWT较基础值进行性下降,术后一周即下降至基础水平的51%(p<0.01)以后在整个观察其间均维持在该低水平。而术后第14天,STZ组大鼠脊髓腰膨大处小胶质细胞中M1型标记蛋白CD86较对照组明显升高(p<0.01)。(3)经LPS、IL-4孵育BV2小胶质细胞后,Western Blot示LPS组M1型标记蛋白i NOS较其他两组明显升高(p<0.01),IL-4组M2型标记蛋白Arg较其余两组明显升高(p<0.01);流式细胞术检测示,LPS组M1型标记蛋白CD86较其他两组明显升高,IL-4组M2型标记蛋白CD206较其余两组明显升高(p<0.01);免疫荧光共聚焦亦显示LPS组M1型标记蛋白i NOS荧光强度较其他两组明显升高,IL-4组M2型标记蛋白Arg荧光强度较其余两组明显升高(p<0.01)。(4)经LPS、IL-4孵育原代小胶质细胞后,Western Blot示LPS组M1型标记蛋白i NOS较其他两组明显升高,IL-4组M2型标记蛋白CD206较其余两组明显升高(p<0.01);免疫荧光共聚焦亦显示LPS组M1型标记蛋白CD86较其他两组明显升高,IL-4组M2型标记蛋白Arg较其余两组明显升高(p<0.01)。(5)将经LPS孵育的原代小胶质细胞鞘内注入正常大鼠体内,大鼠的机械痛阈较对照组明显降低,提示M1型小胶质细胞可以促进疼痛行为学。(6)将经IL-4孵育的原代小胶质细胞鞘内注入糖尿病性神经痛和SNL神经损伤致神经病理性疼痛大鼠体内,疼痛大鼠的机械痛阈明显升高,提示M2型小胶质细胞可以缓解疼痛。结论脊髓小胶质细胞极化状态的改变参与了神经病理性疼痛的调控,其间M1型可以促进疼痛行为学;相反的,M2型可以缓解疼痛行为学。第二部分ATP调控小胶质细胞极化状态进而参与神经病理性疼痛的机制研究目的探究ATP调控小胶质细胞极化状态进而参与神经病理性疼痛的机制(1)离体实验中,ATP对BV2小胶质细胞极化状态的影响;(2)鞘内注入经不同浓度ATP孵育的原代小胶质细胞对大鼠疼痛行为学的影响。方法(1)离体实验中,ATP对BV2小胶质细胞极化状态的影响不同浓度ATP孵育BV2小胶质细胞24小时后,分别以Western Blot、流式细胞术和免疫荧光共聚焦测定各组细胞中M1型和M2型小胶质细胞标记蛋白的表达变化情况;以低浓度ATP(10μM)+LPS孵育BV2小胶质细胞24小时后,分别以Western Blot、流式细胞术和免疫荧光共聚焦测定各组细胞中M1型和M2型小胶质细胞标记蛋白的表达变化情况。(2)鞘内注入经不同浓度ATP孵育的原代小胶质细胞对大鼠疼痛行为学的影响分别将经低浓度ATP(10μM)、LPS、ATP(10μM)+LPS孵育的原代小胶质细胞经鞘内注入正常大鼠体内,观测大鼠疼痛行为学的变化;分别将经高浓度ATP(1m M)、IL-4孵育的原代小胶质细胞鞘内注入神经病理性疼痛大鼠体内,观测大鼠疼痛行为学的变化。结果(1)经不同浓度ATP孵育BV2小胶质细胞24小时后,Western Blot示低浓度组中M1型标记蛋白i NOS无明显变化,而高浓度组i NOS表达下调(p<0.01);流式细胞术示低浓度组M1型标记蛋白CD86和M2型标记蛋白CD206无明显变化,而高浓度组CD86表达下调,CD206表达增高(p<0.01);免疫荧光共聚焦亦显示低浓度组M1型标记蛋白i NOS和M2型标记蛋白Arg无明显变化,仅在高浓度组i NOS表达减少,Arg表达上调(p<0.01)。(2)以低浓度ATP(10μM)+LPS孵育BV2小胶质细胞24小时后,Western Blot示ATP组M1型标记蛋白i NOS表达较对照组无明显差异,而ATP+LPS组较单纯LPS组及对照组i NOS表达均明显增高(p<0.01);流式细胞术示ATP组M1型标记蛋白CD86和M2型标记蛋白CD206无明显变化,而ATP+LPS组CD86表达上调,CD206表达下降(p<0.01);免疫荧光共聚焦亦显示ATP组M1型标记蛋白i NOS和M2型标记蛋白Arg无明显变化,仅在ATP+LPS组i NOS表达增高,Arg表达下降(p<0.01)。(3)将经低浓度ATP+LPS孵育的原代小胶质细胞经鞘内注入正常大鼠体内,大鼠的机械痛阈明显降低(p<0.01),且持续时间较ATP组、LPS组明显延长,提示低剂量ATP可以增强LPS诱导M1型小胶质细胞的能力,进而促进疼痛的发生。(4)将经高浓度ATP孵育的原代小胶质细胞鞘内注入神经病理性疼痛大鼠体内,疼痛大鼠的机械痛阈明显升高(p<0.01),提示高浓度ATP可以诱导小胶质细胞向M2型极化,进而缓解疼痛行为学。结论ATP可以调控小胶质细胞的极化状态进而参与神经病理型疼痛的发生发展,低浓度ATP可以增强LPS诱导M1型小胶质细胞的能力,促进疼痛;而高浓度ATP可以直接诱导M2型小胶质细胞,缓解疼痛行为学。