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目的:自噬是细胞降解异常细胞器及蛋白的一种代谢方式,对维持细胞内环境的稳态有着重要作用。神经元是人体内特殊的永久性细胞,高度依赖自噬维持的细胞稳态和有对高水平ATP和蛋白质合成的需求。作为一种神经退行性疾病,阿尔茨海默病(AD)发病早期便可观察到自噬体堆积于轴突末梢发生自噬障碍,这是发生和发展的重要因素。有研究显示,Curcumin(姜黄素)作为一种二酮类植物化合物,在AD中可增强自噬,但其作用机制尚未阐明。本研究拟通过构建AD细胞模型,首先观察Curcumin对自噬及自噬流的影响;然后观察Curcumin对自噬体轴突转运后与溶酶体结合的影响;再深入分析Curcumin对AD自噬体轴突转运的作用是否通过调控正向分子马达和/或逆向分子马达。本研究将从新的角度探讨Curcumin对AD的保护机制,有望为AD的治疗提供新的思路。方法:首先构建N2a/APP695swe细胞,将细胞分组:WT组(WT/N2a细胞组),APP组(N2a/APP695swe细胞),DMSO组(5μmol/l DMSO溶液处理N2a/APP695swe细胞24h),Curcumin(CUR)组(5μmol/l Curcumin处理N2a/APP695swe细胞24h)。首先在透射电镜下观察细胞内自噬体结构,免疫荧光检测自噬标记蛋白LC3和底物蛋白P62的表达,RT-PCR和Western Blot分别检测LC3与P62的mRNA水平和蛋白表达水平,Western Blot检测自噬发生的相关蛋白Beclin1、Atg5和Atg16L1的表达。进一步利用免疫组化和Western Blot检测溶酶体标记蛋白LAMP2的表达,共聚焦显微镜观察自噬体与溶酶体结合情况,并利用溶酶体抑制剂进一步量化自噬流。然后用Western Blot检测顺向转运蛋白KIF、逆向转运蛋白Dynein(DIC、DHC和DLC)、动力蛋白相关蛋白P150、P50、BICD2与脚手架蛋白Huntingtin和RILP的表达,应用动力蛋白抑制剂EHNA后检测自噬流的改变,共聚焦显微镜下观察自噬体标记蛋白LC3与逆向轴突转运相关蛋白BICD2是否有相互作用。结果:与APP组相比较,电镜结果显示Curcumin组和WT组中自噬体样结构明显增多;并且免疫荧光和RT-PCR显示LC3的表达和LC3 mRNA的水平也增多,但是P62蛋白表达和P62 mRNA水平却减少;Curcumin处理组LC3II、Beclin1、Atg5和Atg16L1的表达增多,而P62表达却减少;免疫组化和免疫荧光显示LAMP2的表达和自噬溶酶体数量在WT组和Curcumin组均较多;Western Blot结果表明巴筏洛霉素抑制溶酶体后,LC3II和P62均表达增加,接着再用Curcumin处理后能继续轻微增加LC3II和降低P62的表达;动力蛋白DIC、DHC和DLC的表达增多,而驱动蛋白KIF却减少,并且动力蛋白抑制剂EHNA能降低LC3II和P150的表达,而Curcumin能增加EHNA引起的LC3II的表达并能降低P62的表达水平;Western Blot检测结果还表明,Curcumin组P150、P50、BICD2、RILP和Huntingtin的表达增加;免疫荧光发现Curcumin组BICD2和LC3有共定位,以上结果表明Curcumin促进Dynein-Dynactin-BICD2逆向轴突转运复合物的形成。结论:Curcumin可以诱导N2a/APP695swe细胞自噬并促进溶酶体与自噬体溶合,增强自噬体轴突转运相关蛋白的表达和相互作用,改善自噬体的轴突转运,从而促进自噬流,为Curcumin治疗AD提供新的理论依据。