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小球藻(Chlorella)属于一类单细胞的绿藻,是微藻中蛋白质含量最高的种类之一,具有良好的医疗保健功效,是具有重要商业价值的微藻资源。但是,目前尚无相关研究证明小球藻中发挥高生物活性的主要物质由何种组分构成,以及不同的组分具有何各自的生物学活性和功能。本文利用本实验室建立的高压均质法并结合纤维素酶与果胶酶酶解细胞壁对小球藻进行破壁,提取小球藻蛋白。通过筛选最适蛋白酶以及利用响应面法优化蛋白酶复合酶解多肽制备工艺,利用超滤膜多级分离技术获得不同分子量区段的小球藻酶解多肽,进而开展体外抗氧化功能实验、细胞实验以及老龄小鼠体内实验3个方面的研究,探究不同分子量区段的小球藻酶解多肽的抗氧化活性。主要研究结果如下:1.为确定获得最佳抗氧化酶解多肽片段的最适蛋白酶和酶解条件,以体外总还原能力为指标,根据不同蛋白酶酶解产物总还原能力的强弱筛选最适蛋白酶,确定经碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合酶解小球藻蛋白后的酶解产物总还原能力最高。进一步采用响应面法确立了碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合酶解小球藻蛋白的最适参数:pH 8.8、酶解温度60℃、加酶量2.2%、酶解时间30.0 min、底物浓度4.0%、碱性蛋白酶与胰蛋白酶配比为5:1,该条件下测得实际蛋白水解度为71.06%。2.蛋白酶复合酶解后的酶解液经超滤膜多级分离技术,获得分子量为>10 kDa、5-10 kDa、3.5-5 kDa、1-3.5 kDa 和<1 kDa 的酶解多肽。3.通过体外抗氧化能力与总还原能力的检测,确定1-3.5 kDa的酶解多肽的体外抗氧化能力的效果最好。当1-3.5 kDa的酶解多肽浓度为10 mg/mL时,DPPH自由基清除率为88.53%。1-3.5 kDa的酶解多肽浓度为12.5 mg/mL时,羟自由基清除率为96.81%。通过SPSS软件回归分析得,1-3.5 kDa的酶解多肽对DPPH及羟自由基清除率的半抑制浓度(IC50)分别为2.62 mg/mL和5.74 mg/mL。进一步通过Bel7402人肝癌细胞实验,证实1-3.5 kDa的酶解多肽能够在细胞内发挥抗氧化作用,降低细胞内ROS水平。4.利用老龄小鼠实验检测各分子量区段酶解多肽的体内抗氧化能力,再次确认1-3.5 kDa的酶解多肽在降低脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平,提高抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活力方面能力最为显著,且呈现出明显的多肽剂量依赖性。1-3.5 kDa区段的酶解多肽组与对照组和其他多肽组相比,小鼠血清中MDA由对照组6.81 nmoL/mL下降到4.68 nmoL/mL。GSH-PX活性由对照组545.74 U/mL上升到950.46 U/mL。SOD活性由对照组173.33 U/mL 上升到 209.28 U/mL。综上所述,碱性蛋白酶与胰蛋白酶复合酶解后的小球藻酶解多肽具有抗氧化活性,特别是分子量为1-3.5 kDa区段的酶解多肽的抗氧化功能最显著。本研究能够为大规模酶解小球藻蛋白获取抗氧化肽和拓展小球藻酶解多肽的更深层开发提供技术和理论依据。