适配子磁性微球是将特异性适配子与磁性微球相连接,适配子可以与靶物质特异性结合,利用磁性微球在外加磁场的作用下即可使靶物质与周围介质分离,从而实现分离富集靶物质的目的,此方法不仅操作简单而且灵敏度高。多重PCR法是在一个扩增体系中加入多对引物,同时扩增出多个核酸片段,具有快速、灵敏度高、特异性强等特点。将适配子磁性微球分离与多重PCR结合可以兼具两者的优势,实现单增李斯特菌的快速、准确检测。本研究在已经筛选得到单增李斯特菌适配子的基础上,将适配子固定于磁性微球表面,制成适配子磁性微球用于富集单增李斯特菌。结合多重PCR法建立一种快速检测单增李斯特菌的方法。主要研究内容及研究结果如下。1.聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球的制备采用共沉淀法制备四氧化三铁磁性纳米粒子,比较了柠檬酸钠、PEG-20000、PEG-4000及油酸4种分散剂,发现油酸作为分散剂时磁性微球的粒径均匀、分散性好。油酸修饰四氧化三铁的最佳条件为氨水添加量25 mL,油酸添加量3 mL,反应时间1 h。采用乳液聚合法制备了核壳型聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球,经TEM、XRD、FT-IR、VSM对四氧化三铁磁性微球、油酸修饰四氧化三铁磁性微球、聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球进行表征,结果显示制备的磁性微球纯度较高,为单一相的四氧化三铁,立方晶系,分散性良好,聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球的饱和磁化强度为49.5 emu/g且为超顺磁性。电导滴定法测得聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球表面生成的氨基含量为2.14 mmol/g,为连接链霉亲和素提供活性基团。2.适配子磁性微球富集单增李斯特菌采用共价结合法将链霉亲和素结合到聚苯乙烯/丙烯酰胺磁性微球的表面,制备链霉亲和素磁性微球。竞争结合法测得链霉亲合素磁性微球与生物素及生物素标记的适配子的结合能力分别为7.58 nmol/mg和0.14 nmol/mg。链霉亲和素磁性微球与生物素标记的单增李斯特菌适配子相连制得适配子磁性微球,用于富集单增李斯特菌。适配子磁性微球在最佳捕获条件下,100μL单增李斯特菌菌液中(103CFU/mL)加入0.05 mg适配子磁性微球,孵育150 min,平板计数法测得对单增李斯特菌的捕获效率为65%。3.适配子磁性微球分离结合多重PCR检测单增李斯特菌本研究比较了 12对引物,确定iap6作为李斯特菌属特异性引物,hly1作为单增李斯特菌种特异性引物,用于多重PCR检测。经过DNA提取方法、PCR反应体系的引物浓度和退火温度的优化,建立检测单增李斯特菌的多重PCR。该方法可以检测到0.015 ng的单增李斯特菌DNA。同时本研究在富集到的菌液中加入PMA,特异性地提取活细胞DNA,避免了假阳性结果。102 CFU和103 CFU单增李斯特菌人工污染食品样品,增菌培养后多重PCR检出时间分别为6h、4h,而经磁性微球富集后再进行多重PCR的检出时间分别为4 h、2 h。表明该方法可以简化样品处理过程,缩短检测时间。