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RNA干扰技术(RNAi)在HIV-1治疗研究方面已展示出很好的应用潜力。然而,由于HIV-1病毒的高突变率,其在RNAi靶点序列的碱基突变可显著降低或解除RNAi介导的抑制效果。因此寻找有效的抗病毒突变策略是目前RNAi治疗HIV-1研究的重点。多靶点抑制策略有望降低病毒逃逸突变对RNAi治疗措施的影响,本研究即探讨构建可高效靶向HIV-1以及HIV-1细胞受体蛋白的多靶点RNAi元件。本实验室在之前的研究中,设计了165个靶向HIV-1基因组不同保守区域的siRNA,通过筛选获得了一批能够高效抑制HIV-1的RNAi靶点,包括siRNA-vif37、siRNA-poll102以及siRNA-poll402等,其中siRNA-vif37靶向HIV-1 vif/pol基因的重叠区域,siRNA-poll102、siRNA-poll402靶向HIV-1 pol基因。shRNA表达载体是表达siRNA的常用方式,然而研究显示RNA聚合酶Ⅲ类启动子介导的shRNA表达量过高,可能导致细胞内源RNAi干扰途径的饱和,引发毒性效应。从miRNA转录本产生siRNA是一种更为理想的方式,miRNA可以通过RNA聚合酶Ⅱ类启动予介导表达,可以实现低水平及可控表达,有望更好地控制毒性效应。本研究采用miRNA框架策略,通过将RNAi靶点序列导入mir-155及mir-30a框架,用于构建抗HIV-1的人工miRNA元件。由于siRNA与miRNA的长度存在差异,将siRNA导入miRNA时需要适当补充siRNA靶点序列相邻的碱基以模拟天然miRNA结构达到最佳的抑制效果,本研究构建了具有不同相邻序列的miRNA表达元件,通过共转染抑制实验的筛选获得了可靶向具有较好抑制能力的miRNA元件(mir-v37H、mir-pll02G和mir-p1402B),进一步进行对不同亚型HIV-1的共转染抑制实验,结果显示上述miRNA元件均能有效抑制不同亚型HIV-1的表达。为了从HIV-1进入细胞的途径上抑制HIV-1感染,本研究选择细胞膜受体CCR5作为抑制HIV-1的补充靶点。CCR5是R5型HIV-1感染细胞的必须辅助受体并且广泛分布于CD4~+细胞以及肠粘膜。本研究选择了16个靶向CCR5的RNAi靶点,以mir-30a为基础框架构建miRNA表达元件,通过构建的报告基因筛选系统筛选获得了1个具有较好抑制能力的miRNA元件(mir-CCR13A)。本研究进一步通过3个人工设计的连接序列地将本研究获得的4个miRNA元件串联起来,获得了多靶点miRNA元件(miCVPP)。本研究采用的连接序列来源于HIV-1 erv基因的反义序列。通过对每个靶点miRNA的抑制能力验证,本研究构建的miCVPP可以同时用于表达4个miRNA元件,不同靶点的miRNA均可有效抑制荧光素酶-Target融合报告基因以及HIV-1的表达。应用重组慢病毒载体系统,本研究构建了携带miCVPP元件的重组慢病毒载体,通过慢病毒载体将miCVPP元件导入HIV-1受体细胞株MT-4,筛选获得了稳定整合miCVPP元件的细胞株MT4-miCVPP。通过荧光半定量PCR方法检测MT4-miCVPP细胞中各靶点成熟miRNA的表达情况,结果显示MT4-miCVPP细胞中miCVPP可以得到有效表达,并分别加工成熟4种单靶点miRNA。进一步对MT4-miCVPP细胞进行干扰素效应、细胞毒性以及细胞增殖检测实验,结果显示携带miCVPP表达元件的MT4-miCVPP细胞生长增殖正常,所携带的RNAi元件未显示出明显的脱靶效应。以高滴度的HIV-1对MT4-miCVPP细胞进行攻毒实验,结果显示MT4-miCVPP细胞相比对照细胞具有更好的抵抗HIV-1感染能力,与携带单靶点miRNA元件的MT-4细胞株相比,MT4-miCVPP细胞可以更持久的抑制HIV-1的表达和复制,从而抑制突变病毒的产生。本研究构建的miCVPP多靶点元件,为进一步开展HIV-1的RNAi基因治疗研究提供了重要的基础。