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microRNA (miRNA)是一类在转录后水平调控基因表达的内源性非编码小RNA(Wightman et al.1993;Reinhart et al.2000),在机体内广泛地参与许多生命过程的调控,包括细胞分化、细胞凋亡、能量代谢和癌症等(Alvarez-Garcia and Miska 2005)。近年来,研究显示一些miRNA对脂肪细胞分化具有明显的调节作用,如miR-143(Esau et al.2004)和miR-17-92簇(Wang et al.2008)促进脂肪细胞分化、let-7(Sun et al.2009)和miR-27(Lin etal.2009)抑制脂肪细胞的分化；miR-8(Jennifer et al.2008)可以促进骨髓基质细胞向脂肪细胞方向分化。另外,有研究显示miR-196 (Esau et al.2004; Hackl et al.2005)在脂肪细胞分化过程中差异表达,可能参与脂肪形成的调节。之前的研究证实miR-196a在成骨分化(Kim etal 2009)、肢体发育(Hornstein et al.2005)、尾再生(Sehm et al.2009)和癌症发生(Schimanski et al.2009)等生物过程中均起重要的调控作用。但是,miR-196a在脂肪细胞分化的作用还不明确。此外,miRNA具有高度的物种保守性,结合之前的研究,我们推测miR-196a参与调控猪前体脂肪细胞的分化。为了验证这个假设,本研究以猪原代脂肪细胞为试验材料,研究miR-196a在猪原代脂肪细胞增殖分化中的作用,为明确miRNA调控细胞增殖分化的研究提供新的参考材料,也为动物育种工作提供重要的理论依据。而我们构建的miR-196a的表达载体,可用于进一步研究miR-196a参与的一些基因调控以及脂类代谢相关疾病的机理。1、miR-196a的组织分布利用3日龄和6月龄猪的各种组织为试验材料,采用Real-Time PCR检测miR-196a的表达情况。real-time PCR结果显示,miR-196a在3日龄仔猪和6月龄成猪的所有检测组织中均有表达。值得注意的是,在所有检测组织中,miR-196a在3日龄仔猪的脂肪组织中表达水平最低,但是在6月龄成猪的脂肪组织中表达水平最高。揭示其可能在猪脂肪组织发育过程中起重要的调控作用。2、miR-196a对猪前体脂肪细胞增殖分化的影响将pcDNA3.0-miR-196a转染猪前体脂肪细胞,分别在转染后的1-5d对细胞增殖情况进行MTT检测、转染后48h对脂肪细胞分化关键转录因子进行real-time PCR检测以及转染和诱导分化后的第6d对脂滴的累积进行Oil Red O染色。MTT检测结果显示,miR-196a对猪前体脂肪细胞的增殖没有明显影响；real-time PCR和Oil Red O染色结果显示,转染pcDNA3.0-miR-196a的猪前体脂肪细胞中,脂肪细胞分化关键基因PPARγ、C/EBPα和LPL的表达水平及脂滴累积明显增加。上述研究结果指明,miR-196a不参与猪前体脂肪细胞的增殖,但参与调控猪前体脂肪细胞的分化。3、miR-196a靶基因的生物信息学分析本研究采用RNA22预测软件识别了miR-196a的潜在靶基因,包括：sirt1、wnt3a、wnt10a和wnt10b。其中在前三个基因的mRNA序列中各有2个耙作用位点,在wnt10b基因的mRNA中有4个耙作用位点。另外,猪脂肪细胞分化的关键转录因子PPARγ、C/EBPα、LPL、aP2和SREBP基因的mRNA中没有miR-196a的耙作用位点,揭示miR-196a可能通过sirt1、wnt3a、wnt10a和wnt10b间接调控PPARγ、C/EBPα、LPL基因的mRNA表达,从而促进脂肪细胞的分化。