【摘 要】
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目的:erl(erlong,erl)小鼠是在C57BL/6J小鼠背景基础上,新近筛选制备的研究非综合征常染色体隐性遗传性耳聋(DFNB12)的模型小鼠。erl是钙粘蛋白23基因新发现的等位基因位点,
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目的:erl(erlong,erl)小鼠是在C57BL/6J小鼠背景基础上,新近筛选制备的研究非综合征常染色体隐性遗传性耳聋(DFNB12)的模型小鼠。erl是钙粘蛋白23基因新发现的等位基因位点,该基因突变导致CDH23蛋白第一个细胞外结构域(CDH23EC1)氨基酸发生替换(S47P),引起CDH23蛋白二级结构如a-螺旋、β-折叠等的改变,影响蛋白质高级结构的组成。本课题旨在研究CDH23钙黏蛋白氨基端前两个细胞外结构域(EC1+2)的钙离子结合性能,探讨erl小鼠听力损害的可能机制。方法:本研究利用基因工程技术,在大肠杆菌中表达erl小鼠CDH23的前两个细胞外结构域,进一步鉴定该重组蛋白与Ca2+结合性能的改变。在体外分别合成来自野生型和erl小鼠的CDH23EC1+2的DNA序列,并将其克隆到pBV220质粒中。将重组质粒转化大肠杆菌,通过温度诱导的方式(从30℃升高至42℃)诱导CDH23EC1+2在大肠杆菌中表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白,并用Western Blot鉴定其抗原性。用8M尿素溶解包涵体,通过离子交换层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,并在含有0.1%sarkosy1的透析液中通过透析复性的方法使其再折叠。采用Mag-Fluo4 Ca2+荧光探针和Ca2+依赖性的胰蛋白酶水解保护实验鉴定重组蛋白CDH23 EC1+2的Ca2+结合性能。结果:重组质粒中的插入片段与预期的大小及序列一致,重组蛋白以包涵体的形式表达于大肠杆菌,具有抗原性。将包涵体变性、复性后,用圆二色谱法(CD)进一步证实了重组蛋白的二级结构。Mag-Fluo4 Ca2+荧光探针和Ca2+依赖性的胰蛋白酶水解保护实验表明,与野生型CDH23EC1+2相比,来自erl小鼠的CDH23EC1+2的Ca2+结合能力减弱。结论:Ca2+依赖性蛋白质相互作用的损害可能参与erl小鼠渐进性听力损失的发生发展过程。该结果有助于进一步揭示DFNB12听力损失的机制。
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