在世界范围内，恶性肿瘤的发病率和死亡率仍然居高不下，其诊断和治疗依旧是目前医学研究领域中亟待解决的难题。其中，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重影响患者身心健康甚至危及生命。研究恶性肿瘤相关贫血及其机制可为临床患者的相关治疗提供重要的理论基础。为了更深入的了解癌症，贫血和红细胞生成系统之间的关系，我们应用小鼠乳腺癌模型检测了脾脏在荷瘤鼠中的红细胞生成作用及其机制。　　目的:　　1、在生理条件下，红细胞的生成过程受复杂的反馈机制调节，以使循环系统内红细胞(RBCs)数量维持在机体适宜的水平。在慢性感染，恶性肿瘤，慢性肾脏疾病等慢性炎症条件下可发生炎症性贫血，是临床上最常见的一种贫血形式。体内铁含量以及蛋白质等的营养缺乏，红细胞的寿命缩短，促红细胞生成素(Epo)的合成减少，以及骨髓造血功能受损等都可影响体内红细胞生成。因此，肿瘤负荷鼠的贫血状况以及分析引起荷瘤鼠贫血的原因，是本文的研究目的之一。　　2、人体在出生后，红系祖细胞主要在骨髓内分化、发育、成熟。机体功能紊乱时，脾脏开始进行应激性的红细胞生成。因此，乳腺肿瘤对骨髓红细胞生成的影响以及荷瘤鼠中脾的应激红细胞生成作用是本文的另一个研究目的。3、脾的应激性红细胞生成作用需要巨噬细胞分泌的骨形态生成蛋白4(BMP4)的参与，其可刺激脾内红系祖细胞增殖并分化成红系爆式集落形成单位(BFU-E)，且快速发育为成熟的红细胞。因此，肿瘤负荷鼠中脾红细胞生成的分子机制是本文的又一研究目的。　　方法:　　第一部分:乳腺肿瘤负荷小鼠贫血状况及贫血原因分析　　1、小鼠乳腺癌模型的建立及贫血状况的测定　　1.1实验小鼠随机分组，建立小鼠乳腺癌模型。　　1.2小鼠接种肿瘤细胞后第4周，取血，用血细胞自动分析仪检测实验小鼠循环系统内红细胞数量、血红蛋白含量、红细胞压积以及网织红细胞数目。　　2、乳腺肿瘤负荷小鼠血清内炎症因子的变化　　乳腺肿瘤细胞在小鼠乳腺原位接种后，不同时间点取小鼠血清，采用Elisa的方法检测炎性因子IL-6，IFN-γ，TNF-α的相关变化。　　3、荷瘤鼠体内血清铁含量的测定　　用血清铁及总铁结合力检测试剂盒测定荷瘤鼠体内血清铁及转铁蛋白饱和度的变化。　　第二部分:乳腺肿瘤对小鼠骨髓内红细胞生成情况的影响　　1、肿瘤负荷鼠股骨外观变化　　1.1脱颈处死小鼠，剥离其股骨，观察其外观的改变。　　1.2用充满生理盐水的注射器将小鼠股骨骨髓冲出，制备成单细胞悬液，在显微镜下用细胞计数板检测荷瘤鼠骨髓内总细胞数的变化。　　2、乳腺肿瘤对骨髓内红系祖细胞的影响　　用相应的甲基纤维素半固体培养基对小鼠骨髓内BFU-E，CFU-E分别进行原代培养，一定时间后在显微镜下观察各自形成的集落数目，并计数。　　3、乳腺肿瘤对骨髓内红系细胞分化的的影响　　用CD71和Ter119抗体与骨髓细胞共孵育，流式细胞仪检测乳腺肿瘤对骨髓内红系细胞分化的影响。　　第三部分:乳腺肿瘤负荷小鼠脾脏应激性红细胞生成作用　　1、乳腺肿瘤对小鼠脾形态的影响　　1.1脱颈处死小鼠，取小鼠脾脏，观察其外观并称量脾的重量。　　1.2将小鼠脾脏研磨成单细胞，并制备成单细胞悬液，在显微镜下用细胞计数板检测荷瘤鼠脾内总细胞数的变化。　　2、乳腺肿瘤对脾内红系祖细胞的影响　　取小鼠脾脏，研磨成单细胞后，用红细胞裂解液裂解红细胞，相应的甲基纤维素半固体培养基分别对小鼠脾内BFU-E，CFU-E进行原代培养，一定时间后在显微镜下观察其形成的集落数目，并计数。　　3、乳腺肿瘤对脾内红系细胞分化的影响　　用CD71和Ter119抗体与小鼠脾细胞共孵育，流式细胞仪检测乳腺肿瘤对脾内红系细胞分化的的影响。　　第四部分:脾切除对肿瘤诱导的应激性红细胞生成作用的影响　　1、脾切除对荷瘤鼠循环系统内血细胞的影响　　1.1对正常小鼠进行脾的切除手术，两周后给小鼠接种肿瘤细胞。　　1.2在小鼠接种肿瘤细胞后的第1，2，3，4周时，取血，用血细胞自动分析仪检测小鼠外周血中各类血细胞的相关情况。　　2、脾切除后荷瘤鼠血清内主要的炎性因子的变化　　采用Elisa的方法检测脾切除的荷瘤鼠血清内主要的炎性因子IL-6和IFN-γ的相关变化。　　3、脾切除的肿瘤负荷鼠体内血清铁含量的测定　　用血清铁及总铁结合力检测试剂盒测定脾切除后的乳腺肿瘤负荷鼠体内血清铁及转铁蛋白饱和度的变化。　　第五部分:巨噬细胞在肿瘤引起的脾脏应激性红细胞生成中的作用　　1、删除体内的巨噬细胞对荷瘤鼠循环系统内红细胞的影响　　1.1在小鼠接种肿瘤细胞后的第7天和第18天时给小鼠尾静脉注射脂质体-氯曲膦酸以删除体内的巨噬细胞。　　1.2小鼠接种肿瘤细胞后的第4周，取血，用血细胞自动分析仪检测删除了巨噬细胞的荷瘤鼠循环系统内红细胞数量，血红蛋白含量以及红细胞压积的改变。　　2、脂质体-氯曲膦酸对荷瘤鼠脾脏应激性红细胞生成作用的影响　　2.1对注射脂质体-氯曲膦酸的荷瘤鼠和注射脂质体的荷瘤鼠脾内BFU-E，CFU-E进行原代培养，观察脂质体-氯曲膦酸对肿瘤负荷鼠脾内红系祖细胞的影响。　　2.2取各实验小鼠脾脏，研磨，制备单细胞悬液，用CD71和Ter119抗体与脾细胞共孵育，流式细胞仪检测巨噬细胞删除对荷瘤鼠脾内红系细胞分化的影响。　　结果:　　第一部分:乳腺癌荷瘤小鼠表现出贫血表型，其血清内G-CSF含量显著升高　　1、小鼠乳腺癌模型的建立及贫血状况的测定　　用血细胞自动分析仪检测发现，在小鼠乳腺癌移植模型4T1乳腺肿瘤负荷鼠中，外周血红细胞数量，血红蛋白含量以及红细胞压积与正常小鼠相比均明显降低，而网织红细胞数目反馈性地增高。　　2、乳腺癌荷瘤小鼠血清内炎性因子的变化　　用Elisa的方法检测发现，随着时间的延长，荷瘤鼠血清内主要的炎性因子IL-6和IFN-γ与正常小鼠一直没有明显区别，IL-6仅在癌症后期稍增高，TNF-α在小鼠血清内未检测到。　　3、荷瘤鼠体内血清铁含量的测定　　用血清铁及总铁结合力检测试剂盒检测发现荷瘤鼠体内血清铁及转铁蛋白饱和度与正常小鼠相比基本上没有明显区别。　　4、荷瘤鼠体内红细胞寿命的检测　　通过用生物素标记红细胞，流式细胞仪检测，流式图及统计结果显示肿瘤负荷鼠与正常小鼠体内的红细胞寿命几近相同。　　第二部分:乳腺肿瘤可通过升高体内的G-CSF破坏骨髓内红细胞生成　　1、肿瘤负荷鼠股骨外观变化　　肿瘤负荷鼠的股骨颜色较正常小鼠明显变白，同时骨髓细胞计数结果显示给小鼠接种肿瘤细胞后，随着时间的延长，荷瘤鼠骨髓内细胞数逐渐减少。　　2、乳腺肿瘤对骨髓内红系祖细胞的影响　　用相应的甲基纤维素半固体培养基培养髓内红系祖细胞，计数结果显示随着肿瘤的不断增长，骨髓内BFU-E和CFU-E的集落数目逐渐减少。　　第三部分:乳腺肿瘤分泌的G-CSF可刺激脾进行应激性红细胞生成　　1、乳腺肿瘤对小鼠脾形态的影响　　在给小鼠接种肿瘤细胞后不同时间点，脱颈处死小鼠，取脾，我们发现在小鼠接种肿瘤细胞后第一周，脾脏较正常小鼠便明显增大，并且随着时间的延长，荷瘤鼠的脾脏逐步增大。脾重和脾细胞计数结果显示，随着肿瘤的不断增长，小鼠脾重逐渐增加，脾内细胞数也逐渐增多。　　2、乳腺肿瘤对脾内红系祖细胞的影响　　用相应的甲基纤维素半固体培养基分别培养脾内红系祖细胞，一定时间后计数，结果显示在小鼠接种肿瘤细胞后第二周，脾内BFU-E和CFU-E的集落数较正常小鼠明显增多，且随着时间的延长，其数量逐渐增多。　　第四部分:脾在乳腺肿瘤引起的应激性红细胞生成中发挥着重要的作用　　1、脾切除对荷瘤鼠循环系统内血细胞的影响　　给正常小鼠进行脾的切除手术，两周后给小鼠接种肿瘤细胞，分别在肿瘤细胞接种后1周，2周，3周，4周时取血测血常规。结果显示，在接种肿瘤细胞后的第二周，脾切除的乳腺肿瘤负荷鼠就表现出严重的贫血，红细胞数目、血红蛋白含量和红细胞压积以及网织红细胞数均明显减少。　　2、脾切除后荷瘤鼠血清内主要的炎性因子的变化　　用Elisa法检测发现脾切除的肿瘤负荷鼠与假手术的肿瘤负荷鼠相比，炎性因子IL-6，IFN-r基本上没有明显区别。　　结论:　　1、小鼠乳腺癌细胞可分泌G-CSF，G-CSF可诱导骨髓红细胞生成抑制，导致乳腺癌荷瘤小鼠贫血。　　2、在乳腺肿瘤应激状态下，小鼠脾脏红细胞生成功能被激发，脾切除后，小鼠外周血红细胞减少明显，贫血症状加重。　　3、荷瘤鼠的贫血状况可促使体内Epo水平升高，Epo可刺激髓外造血器官脾内的巨噬细胞分泌BMP4，BMP4又可促进脾内红系造血祖细胞的增殖并逐步分化为成熟的红细胞，从而缓解贫血状况。　　4、脾切除或巨噬细胞删除可诱导外周血红细胞减少，两者均能抑制乳腺肿瘤的生长，提示病理性的脾内红细胞生成有助于肿瘤生长。