【摘 要】
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鹅细小病毒GPV属于细小病毒科（Parvoridae）细小病毒亚科（Parvovirinae）依赖病毒属（Dependovirus）雁形目依赖细小病毒（Anseriform dependoparvovirus）。该病毒所引起的鹅传染病称为小鹅瘟。主要感染3-20日龄的雏鹅或雏番鸭,该病主要病理特征为败血性病变、纤维素性及渗出性肠炎,最后形成肠内栓塞。该病传播速度快,且具有高度传染性,病死率可高达9
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鹅细小病毒GPV属于细小病毒科（Parvoridae）细小病毒亚科（Parvovirinae）依赖病毒属（Dependovirus）雁形目依赖细小病毒（Anseriform dependoparvovirus）。该病毒所引起的鹅传染病称为小鹅瘟。主要感染3-20日龄的雏鹅或雏番鸭,该病主要病理特征为败血性病变、纤维素性及渗出性肠炎,最后形成肠内栓塞。该病传播速度快,且具有高度传染性,病死率可高达95%以上,给我国水禽养殖业带来严重危害,造成了巨大的经济损失。目前,关于GPV的致病机制研究还是空白,有研究报道细胞自噬与病毒感染关系密切,了解病毒与细胞自噬的关系有助于使我们对GPV的复制过程和致病机制有更深层次的认识。因此本研究从细胞自噬角度来探索GPV与细胞的互作关系,力图为GPV的防控提供更科学的依据。本实验首先研究GPV诱导鹅胚成纤维细胞自噬发生情况,用GPV侵染鹅胚成纤维细胞后,通过电镜、Western blot和荧光质粒共转染等方法检测,发现电镜照片中有大量明显的自噬小体;从DEF中克隆LC3B基因,构建绿色荧光质粒p EGFP-LC3B,随后Western blot结果证明,LC3I/LC3II的比值有明显的变化,并且在48小时时达到最大值;荧光显微镜下出现大量细胞状绿色荧光。以上数据均表明GPV在侵染鹅胚成纤维细胞后诱导细胞发生自噬。接下来分别构建GPV结构蛋白和非结构蛋白的真核表达质粒pc DNA3.0-NS1、pc DNA3.0-NS2、pc DNA3.0-VP1和pc DNA3.0-VP2,分别将其转染进鹅胚成纤维细胞,检测自噬发生情况。通过电镜、Western blot和荧光质粒共转染等方法检测,发现NS1转染进细胞后,电镜照片中有大量明显的自噬小体;Western blot结果有明显LC3I和LC3II两条带,LC3I/LC3II的比值有明显的变化,并且在48小时时达到最大值,荧光显微镜下出现大量细胞状绿色荧光。而NS2、VP1和VP2的质粒转染细胞后,Western blot无明显LC3B条带和变化,荧光显微镜下也无明显绿色荧光。表明GPV诱导宿主细胞发生自噬的关键蛋白为非结构蛋白NS1。随后通过生物信息学方法推测GPV NS1通过激活AMPK/Raptor信号通路来启动细胞自噬。本实验第二部分是探讨细胞发生自噬对GPV复制的影响,分别使用雷帕霉素诱导细胞自噬,另外使用氯喹来抑制细胞自噬的发生。通过Western blot试验,TCID50与荧光定量PCR等试验进行病毒复制的检测。结果表明当雷帕霉素诱导细胞自噬发生后,感染较高浓度的GPV的复制也随着增加;而使用氯喹抑制自噬后,感染较高浓度的GPV的复制也随之减少;但是如果感染的病毒浓度较低时,又表现为相反结果。该结果说明细胞自噬的发生最初目的是细胞主动来抑制病毒感染,而当病毒达到一定规模后,细胞的自噬将变为被动,被病毒所控制,从而加快病毒的复制及感染。综上,本研究确认了GPV诱导细胞自噬的初步机制,并探讨了自噬的发生与GPV的感染关系,为了解GPV的复制和致病机制提供一定的参考数据。
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