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β-葡萄糖苷酶(BGL)是一类能够水解β-1,4-D-糖苷键的内切水解酶,属于纤维素酶类,它能够降解纤维二糖生成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶广泛存在于各种动植物和微生物体内,具有重要研究价值,近年来通过对多种来源的β-葡萄糖苷酶的研究和开发,这类酶已在医药、食品、饲料、造纸、印染、纺织、石油开采及生物技术研究等多方面得到了广泛的应用。因此本研究的主要目的是从黑曲霉中获得β-葡萄糖苷酶基因,并构建工程酵母来高效表达β-葡萄糖苷酶,以解决目前β-葡萄糖苷酶产量低、成本高等问题,同时也为纤维素高效降解,生产燃料乙醇提供有效的解决途径。
本研究以黑曲霉Aspergillus niger3.796为材料,依据其他黑曲霉β-葡萄糖苷酶bg1基因序列设计特异性引物,采用RT～PCR方法克隆到β-葡萄糖苷酶基因cDNA全序列。序列分析表明,该cDNA序列全长2583bp,共编码860个氨基酸,该基因已注册GenBank,并利用生物信息学数据库和软件对该基因及其编码蛋白进行了分析和预测。分析结果表明该β-葡萄糖苷酶属于水解酶家族3成员,其氨基酸序列与其它曲霉相比同源性最高可达96％。
本研究利用毕赤酵母Pichia Pastoris GS115分泌表达β-葡萄糖苷酶。将β-葡萄糖苷酶基因克隆到分泌表达载体pPICZaA中,构建重组质粒pPICZaA-bgl。经过同源重组,将其整合到毕赤酵母GS115染色体上,重组位点位于AOX1基因启动子与转录终止子之间。利用Zeocin抗性筛选和PCR检测获得阳性克隆子。将筛选到的阳性克隆子再进行甲醇诱导产酶培养,表达产物经SDS-PAGE电泳分析,相对分子量约为97kD,表达量为0.2-0.3mg/ml。各重组菌的β-葡萄糖苷酶活测定结果为0.184-0.448IU/ml。通过酶学性质研究该酶反应最适pH5.5,最适温度50℃。根据SDS-PAGE电泳和酶活分析,证明目的蛋白己在Pichia pastorisGS115中成功实现表达,但表达量和酶活有待提高。