背景：地中海贫血(简称地贫)是由于珠蛋白基因突变或缺失导致珠蛋白合成障碍的一组遗传性溶血性贫血,其中最常见的是α-地贫和β-地贫。地贫至今仍无有效的治疗办法。导师吴志奎教授课题组,根据中医“肾藏精生髓、髓生血”经典理论,从肾论治治疗地贫,经过三十多年的临床实践,首次对中医药治疗地贫从理论基础、核心病机、治则治法、作用特点和可能机制等提出了较明确的理论认识,形成了系统的理论与有效治法,取得了领先的临床研究成果。通过系列的临床和实验研究,验证了“肾生髓、髓生血”理论指导地贫临床治疗的有效性和科学性。本课题组2006年对112例中间型地贫患者进行中医证候调查,发现地贫患者中医证候多为肝肾阴虚,精血不足证,病情严重程度与季节变化有关,即夏季溶血贫血严重,冬季有所缓解,其证候变化的特点是基本证型未变,但临床症状有明显的季节改变,这种证候季节变化,体现了中医“天人合一,四时阴阳”的整体观,这种证候季节变化可能与血液参数季节性改变有关。既往有关地贫患者证候季节变化的临床报道鲜有,尚未见地贫患者证候季节变化生物学机制研究的报道。本课题是依托国家自然科学基金和“973”研究课题,在前期发现和探索的基础上,探讨季节变化对地贫患者临床证候的影响；从红细胞溶血贫血的角度探讨地贫患者证候季节变化的可能物质基础；并进一步从红细胞溶血贫血的角度探讨益髓生血颗粒治疗地贫的疗效可能机制。目的：以地贫患者为研究对象,从血液指标和中医证候量化评分两个方面探讨季节变化对地贫患者临床表现的影响；从红细胞溶血贫血这一角度阐释地贫患者证候季节变化的可能分子机制,探讨证候季节变化与红细胞溶血贫血的内在关系,为中医“四时”理论指导地贫临床治疗提供部分实验依据。方法：1地贫患者证候季节变化的临床观察 以高发区地贫患者为研究对象,进行了两批次的临床观察。第一批次临床观察：在冬夏两季分别选取一组HbH病患者,冬季组HbH病患者35例,夏季组HbH病患者31例,比较两组HbH病患者血液指标和中医证候量化评分水平的差异,初步探讨季节变化对地贫患者临床证候的影响。第二批次临床观察：选取11例地贫患者(5例α-地贫、6例β-地贫),对11例地贫患者进行冬夏两季的连续观察,动态检测地贫患者冬夏两季血液指标水平并对中医证候进行量化评分,进一步探讨季节变化对地贫患者临床证候的影响。2基于红细胞溶血贫血探讨地贫患者证候季节变化分子机制在临床研究的基础上,针对地贫患者红细胞溶血和贫血的临床特点,采用RT-PCR、ELISA、透射电镜、比色法、比浊法、WB法等分子生物学技术,研究冬夏两季地贫患者红细胞溶血和贫血相关指标(血清铁和血清铁蛋白、红细胞抗氧化损伤、红细胞膜骨架蛋白mRNA表达、红细胞包涵体含量、红细胞膜相关离子通透酶、造血细胞因子)等水平的差异,从红细胞溶血和贫血角度探讨地贫患者证候季节变化的可能分子机制。3基于红细胞溶血贫血探讨益髓生血颗粒治疗地贫的疗效可能机制选取16例地贫患者,从地贫患者红细胞溶血和贫血的角度探讨治疗前后珠蛋白链比、红细胞抗氧化损伤水平、红细胞膜骨架蛋白mRNA表达、红细胞膜相关酶活性、造血细胞因子活性、DNA甲基转移酶mRNA和蛋白表达、BCL11AmRNA的表达等指标水平的变化,探讨益髓生血颗粒治疗地贫的疗效可能的分子机制。结果：1证候季节变化的临床观察1)季节变化对HbH病患者证候影响的临床观察冬季组HbH病患者主要血液指标Hb水平显著高于夏季组HbH病患者(P<0.05),冬季组HbH病患者Ret、HbH水平显著低于夏季组(P<0.05)。冬夏两组HbH病患者RBC水平无明显差异。夏季组缺失型HbH病患者Hb水平显著低于冬季组(P<0.05)；冬夏两组非缺失型HbH病患者Hb水平比较无明显差异。冬季组HbH病患者面色萎黄、爪甲色淡、耳鸣、口咽干燥的中医证候量化评分显著低于夏季组(P<0.01或P<0.05)；腰膝酸软、潮热盗汗中医证候量化评分冬夏两组无明显差异。冬季组非缺失型HbH病患者面色萎黄、耳鸣、口咽干燥的中医证候量化评分显著低于夏季组(P<0.05或P<0.01)。冬季组缺失型HbH病患者面色萎黄、爪甲色淡、腰膝酸软、口咽干燥的中医证候量化评分显著低于夏季组(P<0.05或P<0.01)。冬季组HbH病患者中无论是非缺失型还是缺失型,其大多中医证候量化评分均低于夏季组,提示夏季病情较重,冬季有缓解。初步说明了地贫患者临床症状受季节变化的影响。2)季节变化对同一组地贫患者证候影响的连续观察11例地贫患者冬季主要血液指标Hb水平显著高于夏季(P<0.05),冬夏两季RBC、Ret水平无明显差异。11例地贫患者冬季爪甲色淡、食少纳呆、潮热盗汗的中医证候量化评分显著低于夏季(P<0.05)；头晕目眩、倦怠乏力、腰膝酸软中医证候量化评分冬夏两季无明显差异。同一组地贫患者冬夏两季的连续观察结果进一步说明了地贫患者溶血贫血严重程度受季节变化的影响。2基于红细胞溶血贫血探讨地贫患者证候季节变化分子机制的实验研究1)冬夏两季地贫患者SI、SF水平的检测显示：夏季组HbH病患者SI、SF水平显著高于冬季组(P<0.05)。11例地贫患者冬季SI、SF水平与夏季水平比较差异无统计学意义,但有低于夏季水平的趋势。2)冬夏两季地贫患者红细胞抗氧化损伤水平检测显示：冬季组HbH病患者抗氧化损伤指标SOD活性显著低于夏季组(P<0.05),冬夏两组HbH病患者MDA含量和GSH-Px活性无明显差异。11例地贫患者冬季SOD、GSH-Px活性显著低于夏季(P<0.01),MDA的含量显著也低于夏季(P<0.01)。3)冬夏两季地贫患者红细胞包涵体含量检测显示：地贫患者夏季红细胞包涵体的含量和比例明显多于冬季。4)冬夏两季地贫患者红细胞膜骨架蛋白mRNA表达水平检测显示：冬季组HbH病患者SPTA1、SPTB、EPB4.1 mRNA的表达水平显著高于夏季组(P<0.01)。11例地贫患者冬季SPTA1 mRNA的表达水平显著高于夏季(P<0.05),SPTB、EPB4.1的mRNA表达水平冬夏两季无明显差异。5)冬夏两季地贫患者造血细胞因子活性水平的检测显示：冬季组HbH病患者子SCF活性显著高于夏季组(P<0.05)。冬夏两组HbH病患者IL-3活性水平无明显差异。11例地贫患者冬季SCF.EPO活性水平显著高于夏季(P<0.05或P<0.01),IL-3活性水平显著低于夏季(P<0.05)。6)冬夏两季地贫患者红细胞膜相关酶活性检测显示：冬季组HbH病患者Na+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性显著高于夏季组(P<0.05),冬夏两组HbH病患者Ca2+-Mg2+-ATP酶活性无明显差异。11例地贫患者冬季Nda+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性显著高于夏季(P<0.01或P<0.05),Ca2+-Mg2+-ATP酶活性冬夏两季无明显差异。临床实验研究结果显示：季节变化对地贫患者红细胞溶血贫血相关指标水平的影响,可能是地贫患者存在证候季节变化的重要物质基础之一。3基于红细胞溶血贫血探讨益髓生血颗粒治疗地贫的疗效可能机制3.1益髓生血颗粒治疗16例地贫患者(8例α-地贫、8例β-地贫)的临床观察1)经益髓生血颗粒治疗3个月后,8例α-地贫患者疗后2、3月Hb水平与疗前相比显著升高(P<0.05)；疗后2个月RBC水平显著升高(P<0.05)。8例β-地贫患者疗后1至3个月,Hb水平有升高的趋势,HbF水平显著升高(P<0.01或P<0.05)；疗后2个月Ret水平显著升高(P<0.05)；RBC水平无明显差异。2)经益髓生血颗粒治疗3个月后,16例地贫患者面色萎黄、潮热盗汗、眩晕、心悸、咽干的中医证候量化评分与疗前相比显著降低(P<0.01或P<0.05)；腰膝酸软的中医症候量化评分与疗前相比有降低的趋势。3.2益髓生血颗粒治疗地贫患者疗效分子机制的实验研究1)治疗前后珠蛋白链比结果显示：8例a-地贫患者α-珠蛋白相对β-珠蛋白表达水平与疗前相比显著升高(P<0.01)；Aγ-、Gγ-珠蛋白表达水平相对β-珠蛋白的表达与疗前相比无显著差异。8例8-地贫患者A Y-珠蛋白相对α-珠蛋白的表达水平与疗前相比有升高的趋势,β-、Gγ-珠蛋白相对于α-珠蛋白的表达与疗前相比无明显差异。2)治疗前后DNA甲基转移酶表达结果显示：8例α-地贫患者]DNMT1、 DNMT3a、DNMT3b的]mRNA表达与疗前相比显著降低(P<0.01)；DNMT3a、 DNMT1的蛋白表达水平与疗前相比显著降低(P<0.01),DNMT3b的蛋白表达与疗前相比有降低的趋势。3)治疗前后BCL11A表达水平研究结果显示：8例β-地贫患者BCL11A基因表达与疗前相比显著降低(P<0.05)。4)治疗前后红细胞抗氧化损伤水平结果显示：16例地贫患者GSH-Px、SOD活性与疗前相比显著升高(P<0.01),MDA含量与疗前相比显著降低(P<0.01)。5)治疗前后红细胞膜骨架蛋白表达水平结果显示：16例地贫患者SPTA1、 SPTB的mRNA表达水平与疗前相比显著升高(P<0.05或P<0.01)；EPB4.1mRNA的表达水平与疗前相比无明显差异。6)治疗前后红细胞膜相关酶活性结果显示：与疗前相比,地贫患者Na+-K+-ATP酶、T-ATP酶活性显著升高(P<0.05); Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性与疗前相比无明显差异。7)治疗前后造血细胞因子活性结果显示：地贫患者SCF、GM-CSF的活性与疗前相比显著升高(P<0.01),IL-3的活性与疗前相比显著降低(P<0.01)。从临床疗效观察和红细胞溶血贫血相关指标测定,提示益髓生血颗粒治疗地贫可能与促进红细胞生成,延长红细胞寿命,减少红细胞溶血等方面发挥疗效作用有关。结论：1地贫患者证候季节变化的临床观察通过组间比较和同一组地贫患者的连续观察提示：地贫患者溶血贫血的临床症状存在季节变化的客观性,临床症状的严重程度与主要血液指标Hb水平的变化相一致,即气温高的季节比气温低的季节溶血贫血严重。2地贫患者证候季节变化与溶血贫血相关指标的实验研究1)SI、SF水平检测结果提示：地贫患者夏季SI、SF水平高于冬季。提示地贫患者夏季溶血贫血重于冬季可能与夏季铁超载较重有关。2)氧化损伤指标检测结果提示：地贫患者冬季SOD、GSH-Px舌性低于夏季.MDA的含量冬季显著低于夏季。夏季MDA含量高十冬季,加重了红细胞氧化损伤,激发了体内代偿机制使SOD、GSH-Px活性代偿性升高,从一个侧面提示地贫患者夏季溶血贫血较重。3)红绌胞包涵体含量检测结果提示：地贫患者夏季红细胞包涵体含量高于冬季。包涵体沉积在红绌胞膜上,受氧化和机械损伤作用导致溶血,这可能是地贫患者夏季溶血贫血较重的原因之一。4)红细胞膜骨架蛋白mRNA的表达检测结果提示：地贫患者证候季节变化与红细胞膜骨架蛋白mRNA的表达水平的差异有关。5)造血细胞因子活性检测结果提示：地贫患者夏季贫血重于冬季可能与冬夏两季造血细胞因子活性差异有关。6)红细胞膜相关酶活性检测结果提示：地贫患者夏季溶血重于冬季可能原因之一与冬夏两季红细胞膜离子通透酶活性差异有关。3基于红细胞溶血贫血探讨益髓生血颗粒治疗地贫临床疗效的分子机制3.1治疗前后16例地贫患者(8例α-地贫和8例β-地贫)的临床观察益髓生血颗粒能有效改善地贫患者的临床症状,改善地贫患者主要血液指标Hb水平,患者临床症状改善程度与Hb相一致。进一步验证了益髓生血颗粒治疗地贫的肯定疗效。3.2基于红细胞溶血贫血探讨益髓生血颗粒治疗地贫患者的疗效实验研究1)珠蛋白链比检测结果提示：益髓生血颗粒可能通过促进地贫患者珠蛋白链比的平衡改善地贫患者红细胞溶血贫血。2)DNA甲基转移酶mRNA和蛋白水平检测结果提示：益髓生血颗粒可能通过抑制DNMTs的活性,降低DNA甲基化对α-珠蛋白启动子转录水平的抑制作用,提高α-肽链的合成,促进珠蛋白链比平衡,改善红细胞溶血贫血。3)BCL11AmRNA水平检测结果提示：益髓生血颗粒可能通过下调BCL11A mRNA的表达,促进Aγ-珠蛋白mRNA表达,进而提高机体HbF含量,来缓解患者的贫血症状。与疗后主要血液指标HbF水平升高相一致。4)氧化损伤指标检测结果显示：益髓生血颗粒可能通过提高红细胞抗氧化损伤酶活性,抑制自由基对红细胞膜的过氧化损伤作用,维持红细胞膜结构和功能的完整,延长红细胞的寿命,减轻红细胞溶血贫血。5)红细胞膜骨架蛋白检测结果提示：益髓生血颗粒能上调红细胞膜骨架蛋白收缩蛋白的表达,维持红细胞膜结构完整,减轻红细胞溶血贫血。6)红细胞酶活性检测结果提示：益髓生血颗粒治疗地贫的机制之一可能是通过减轻过氧化物质对红细胞膜的损伤作用来提高红细胞膜酶活性,进而更好的维持红细胞膜变形性、完整性,减轻红细胞溶血贫血。7)造血细胞因子活性检测结果提示：益髓生血颗粒可能通过提高SCF、GM-CSF的活性,促进红系祖细胞和多种造血细胞的增殖和分化,提高有效红细胞生成来缓解地贫患者的临床症状。主要创新点：1以中医“四时”理论对疾病的影响为切入点,首次探索季节变化对地贫患者临床表现的影响,发现地贫患者夏季Hb水平低于冬季,夏季大多中医证候量化评分水平高于冬季。提示,地贫患者夏季溶血贫血较重,冬季有所缓解,病情严重程度受季节变化的影响,并探讨了这种变化的可能分子机制。研究结果为丰富中医“四时”理论并为地贫临床“适时治疗”提供了部分实验依据,具有重要的理论和实际意义。2本研究从季节变化对红细胞溶血贫血相关指标影响的角度,探讨了地贫患者证候季节变化的分子机制：从地贫患者冬夏两季血清铁和铁蛋白、红细胞抗氧化损伤、红细胞膜骨架蛋白、红细胞包涵体含量、红细胞膜离子通透酶活性、造血细胞因子活性等指标水平的变化,探讨了地贫患者夏季溶血贫血重于冬季的可能分子机制,在地贫临床研究领域未见同类报道。