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背景:胃癌,在全世界范围内所有恶性肿瘤中发病率和死亡率位居前列。尤其在我国,每年因胃癌死亡人数约占全世界胃癌死亡总人数的45%。虽然在过去的几十年中,我国胃癌发病率死亡率有所降低,但仍是我国人民健康的巨大威胁。目前有关胃癌发生发展的基础研究越来越多,胃癌的诊断和治疗水平也得到了很大程度的提高。但是有关胃癌侵袭性生长和转移的机制仍未完全明确。近年,有关黏附分子参与恶性肿瘤的报道增多,参与胃癌进展的黏附分子的相关研究也逐渐成为热点。Vinculin,是一种细胞骨架蛋白,也称为黏着斑蛋白,富集在细胞-细胞和细胞-基质黏着部位,参与了细胞的黏附,伸展,迁移及细胞形态维持,力-化学信号转导等多种生理过程。以往研究显示,Vinculin在一些高侵袭性和高转移性的肿瘤细胞中表达异常,或是参与其他信号通路而影响恶性肿瘤的发生发展。但Vinculin在胃癌中所起的作用尚未完全明确。有国外研究报道,塞来昔布可以通过抑制Vinculin基因的表达而抑制胃癌发生及发展,间接提示Vinculin可以促进胃癌的发生发展。因此,我们有必要进一步探索Vinculin在胃癌发生发展中的作用。目的:为了研究Vinculin在胃癌中的作用,并探索相关的调控机制。我们检测了Vinculin在胃癌组织中的表达,研究了Vinculin与胃癌患者临床特点(年龄、性别、肿瘤分化、肿瘤大小、和TNM分期)的相关性,以及分析Vinculin对生存预后的影响。进一步体外实验研究了沉默或过表达Vinculin后,观察它对胃癌细胞或胃正常黏膜上皮细胞的增殖活力、凋亡和迁移的影响。探索了Vinculin上游micro-RNA调控分子。方法:一、Vinculin在胃癌组织及癌旁组织中的表达研究1.收集2012年10月至2015年10月之间青岛市市立医院外科手术切除78例胃癌以及56例癌旁正常胃组织石蜡切块。此外收集同期新鲜手术切除12例胃癌和配对癌旁组织(non-tumor)。收集记录患者姓名、性别、年龄、家族史、病理报告、手术记录等临床资料。2.采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)法检测正常胃黏膜和胃癌组织切片中Vinculin的表达情况。我们采用半定量计分方法,将细胞染色强度和染色细胞所占的比例得分两者相加来判定Vinculin的表达情况。荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测新鲜组织中Vinculin在胃癌和癌旁组织的表达情况。收集患者术后3年病历资料,记录术后生存时间,制作生存分析曲线。二、体外实验研究Vinculin在胃癌细胞系中的表达情况及功能。1.采用qRT-PCR及Western blot方法检测Vinculin在BGC-823、SGC-7901、HGC-27三种胃癌细胞系及正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达水平。2.采用si-RNA瞬时转染技术,在SGC-7901和BGC-823细胞中分别沉默Vinculin后,分别应用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法、流式细胞术和划痕实验对细胞增殖活力、凋亡率和迁移能力进行检测。3.在转染si-RNA沉默胃癌细胞中Vinculin的表达后,利用Western blot检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1和p21、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达以及迁移相关蛋白基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和9的表达。4.利用质粒转染正常胃黏膜上皮细胞GES-1,过表达Vinculin,应用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法、流式细胞术和划痕实验分别对转染后的GES-1细胞活力、凋亡率和迁移进行检测。并使用Western blot检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1和p21、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达以及迁移相关蛋白基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和9的表达。三、研究miR-590-5p与Vinculin在胃癌细胞中的调控关系。1.应用qRT-PCR方法检测miR-590-5p在胃癌组织及癌旁组织中的表达水平。2.应用qRT-PCR方法检测miR-590-5p在BGC-823、SGC-7901、HGC-27三种胃癌细胞系及正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达水平。3.应用荧光素酶实验验证miR-590-5p与Vinculin的靶向关系。4.在BGC-823细胞中,利用miR-590-5p mimic及miR-590-5p inhibitor转染,过表达或敲减miR-590-5p,应用qRT-PCR和Western blot检测过表达或沉默miR-590-5p对Vinculin表达的影响。5.应用si-RNA及miR-590-5p inhibitor同时转染沉默BGC-823细胞中Vinculin以及miR-590-5p的表达,然后分别应用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法、流式细胞术分别对细胞增殖活力和凋亡率进行检测。结果:一、Vinculin在胃癌组织中表达升高以及与胃癌临床特点、预后的关系1.免疫组化实验结果发现Vinculin蛋白阳性染色主要位于细胞核中,少量位于细胞质,表现为棕色或棕黄色颗粒样物质。在胃癌组织中,61.54%(48/78)染色结果为阳性,38.46%(30/78)为阴性,而在正常胃黏膜组织中,25%(14/56)染色结果为阳性,75%(42/56)为阴性,差异有统计学意义(P=0.001)。Vinculin mRNA和蛋白水平在胃癌组织中明显高于癌旁组织。Vinculin的表达与性别(P=0.937)年龄(P=0.884)、肿瘤大小(P=0.817)、M分期(P=0.297)和肿瘤分化(P=0.539)没有显著性关系,而与肿瘤的T分期(P=0.027)和N分期(P=0.007)相关。2.生存曲线分析:Vinculin阴性表达患者术后3年生存率为60.0%,其平均生存时间为30.7月,而Vinculin阳性表达患者术后3年生存率为37.5%,其平均生存时间为25.1月。Vinculin阳性表达患者生存率显著低于阴性表达患者,两者之间具有统计学意义(Log-rank检验,P=0.0364)。二、Vinculin在胃癌细胞中表达升高,并促进胃癌细胞的增殖和迁移1.与人胃正常黏膜上皮细胞GES-1相比,Vinculin mRNA和蛋白在BGC-823细胞(P<0.01)、SGC-7901细胞(P<0.001)和HGC-27细胞(P<0.01)中表达明显升高。2.与si-NC对照组相比,沉默Vinculin能明显降低SGC-7901和BGC-823细胞在24 h、48 h和96 h的细胞增殖活力,沉默Vinculin能明显增加SGC-7901和BGC-823细胞的凋亡及降低细胞迁移能力。3.沉默Vinculin能明显降低SGC-7901,BGC-823细胞中Cyclin D1表达,而明显升高SGC-7901,BGC-823细胞中p21的表达。沉默Vinculin能明显降低SGC-7901和BGC-823细胞中细胞抗凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,降低BGC-823细胞中的迁徙相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达,而明显增加SGC-7901和BGC-823细胞中Bax和裂解型Caspase-3的表达。4.在GES-1细胞中过表达Vinculin能明显促进胃上皮细胞GES-1的细胞增殖活力和迁移能力,而对细胞凋亡影响不明显。三、Vinculin对胃癌细胞的影响受到miR-590-5p的调控1.miR-590-5p在胃癌组织中表达中明显低于癌旁组织(P<0.01)。2.与人胃正常黏膜上皮细胞GES-1相比,miR-590-5p在这三种胃癌细胞系BGC-823(P<0.01)、SGC-7901(P<0.01)和HGC-27(P<0.05)中表达降低。3.靶基因预测网站显示在Vinculin的3’非翻译区(Untranslated Region,UTR)283-289序列位点可能与miR-590-5p相结合,荧光素酶实验验证了Vinculin是miR-590-5p的一个靶基因。miR-590-5p mimic能与Vinculin mRNA结合降低荧光素酶的表达,而结合位点变异后的Vinculin mRNA则不能与之结合。4.过表达miR-590-5p能明显降低Vinculin的mRNA和蛋白表达,而沉默miR-590-5p则呈现相反的结果。5.沉默miR-590-5p后能够反转沉默Vinculin对BGC-823细胞活力的抑制作用,降低沉默Vinculin对BGC-823细胞凋亡的促进作用。结论:1.Vinculin在胃癌组织及胃癌细胞中表达升高,与胃癌的TN分期以及预后相关。2.Vinculin能促进胃癌细胞的增殖及迁移。3.Vinculin在胃癌中的作用可能受到miR-590-5p的调控。