第Ⅰ部分：FGF信号通路与P19细胞神经命运决定 多潜能的小鼠P19胚胎性癌细胞经视磺酸(retinoic acid，RA)诱导，同时形成细胞团，可以分化为神经元和神经胶质细胞。免疫染色显示在RA诱导4天后形成的细胞团中，P19细胞表达神经干细胞特异的标记分子nestin和Sox。这些P19神经干细胞在细胞团内排列成类似神经管的rosette结构，提示RA诱导的P19细胞神经分化过程经过神经干细胞阶段，是一个研究神经细胞命运决定的细胞模型。已有的研究表明，RA诱导和在体外形成具有紧密结构的细胞团是P19细胞神经分化的两个必要条件。为探讨细胞团的形成如何参与决定P19细胞的神经分化命运，我们观察并发现成纤维细胞生长因子8(Fibroblast growth factor 8，FGF8)mRNA和蛋白质的表达水平在P19细胞形成细胞团的24小时内有一过性的上调，提示FGF8是一个P19细胞成团响应分子。在单层培养的P19细胞中过量表达FGF8可以促进RA诱导的P19细胞神经分化，分化后的神经细胞不仅表达神经元的标记性分子TuJ1、MAP2，NF160和GAP43，还表达神经胶质细胞的标记性分子GFAP,提示FGF8的过量表达可以替代P19细胞神经分化必需的成团过程。我们利用RNA干扰，可溶性FGF8受体FGFR3-Fc融合蛋白和FGF受体抑制剂SU5402等方法干扰FGF8信号的传递，均可以抑制RA诱导的P19细胞神经分化，提示成团过程引起的FGF8表达上调对于P19细胞的神经分化是必需的。对FGF8促进P19细胞神经分化分子机制的研究显示，FGF8可以激活其下游信号分子Erk1/2的磷酸化，并干扰了BMP下游转录因子Smad1在细胞核内的定位，以干扰BMP信号通路和促进神经分化。为检验FGF信号通路在P19细胞神经分化过程中是否具有直接的神经诱导功能，我们建立了稳定表达Smad6的P19细胞株，以抑制细胞内的BMP信号通路。该细胞株在无血清条件下可自发分化为神经细胞，而FGFR的抑制剂SU5402和Erk1/2磷酸化的抑制剂U0126可抑制Smad6／P19细胞的神经分化，提示P19细胞成团过程引起的FGF8上调，一方面通过Erk1／2的磷酸化抑制Smadl的入核，另一方面则不依赖BMP抑制，直接促进P19细胞的神经命运决定。 第II部分： 荧光共振能量转移研究bHLH蛋白的相互作用 bHLH(1basic helix-loop-helix)家族成员是脊椎动物神经系统发育中的重要转录调控分子。它们发挥功能的方式是：形成同源／异源二聚体后结合到E-box上启动下游基因的转录。bHLH蛋白同源／异源二聚体在不同细胞中结合的活性强度决定了它们发挥功能的组织特异性和时间特异性。因此，建立在体内条件下观察和研究bHLH蛋白-蛋白相互作用的方法非常有意义。我们构建了一系列bHLH融合蛋白，以荧光共振能量转移(Fluorescence resonanceenergy transfer，FRET)的方法分析bHLH蛋白间的相互作用。我们选择将广泛表达的E47蛋白与EYFP的融合蛋白作为FRET的受体，而将组织特异性表达的NeuroD1，Mash1，Ngn1，Ngn2与：ECFP的融合蛋白作为FRET的供体。通过钙转和鸡胚卵内电转的方法，将上述融合蛋白在HEK293T细胞和鸡胚神经管中瞬时表达。与它们的转录因子功能一致，瞬时表达的bHl_。H融合蛋白定位在细胞核中。而在鸡胚神经管中，80％表达bHLH融合蛋白的细胞定位在神经管：mantle zone(由有丝分裂后的新生神经元构成)，20％定位在ventricularzone(由神经前体细胞构成)。利用受体光漂白的方法计算FRET效率，分析和比较了bHLH蛋白一蛋白在HEK293T细胞和鸡胚神经管mantle zone及ventricular zone内相互作用的强弱。结果提示Mash1和Ngn2可能分别在ventricular zone和mantle zone与其下游基因调控区域的DNA序列形成紧密的DNA-蛋白质转录复合物。