背景骨质疏松是临床常见病、多发病,其主要危害是增加骨折风险,并可导致其他许多并发症。流行病学调查发现骨质疏松已成为临床一种十分常见的疾病,世界范围内,每年有超过200万新增病例,其危害性也被越来越多的临床工作者所重视。临床上现在的治疗策略往往集中在通过降低破骨细胞的骨质吸收作用或者提高成骨细胞的成骨能力来影响患者骨量,已广泛运用临床的特立帕肽,锶盐,二膦酸盐等皆属于此类范畴。然而研究发现此类化学合成药物在长期使用的情况下临床疗效会逐渐减弱,甚至会出现许多药物副作用,这是临床医生和患者都不愿看到的事实,例如研究中有学者发现大剂量的二膦酸盐能诱导颌骨出现骨坏死。因此,临床上期盼一种既能减轻或者是治疗骨质疏松又安全健康的活性药物。大量的研究发现骨质疏松的骨质中骨量的降低和骨髓腔中脂肪组织的增加具有相关性。经典理论认为成骨细胞和骨髓间质中的脂肪细胞来源于同一种前体细胞,即骨髓间充质干细胞。据国外文献报道,绝经后妇女和未绝经妇女相比,其骨髓间充质干细胞产生分化成熟的脂肪细胞的能力是明显增加的。基础研究证据证明,成骨细胞和脂肪细胞在一定意义上有很大程度上的可塑性,从人骨髓间充质干细胞来源的分化成熟的成骨细胞在一定条件下可以去分化或者是分化转移为脂肪细胞,脂肪细胞也有同样的特性,在某种处理情况下由人骨髓间充质干细胞分化而来的成熟脂肪细胞也可以去分化或分化转移为成骨细胞。这个现象提示我们在脂肪细胞和成骨细胞的分化成熟过程中间有一个相互反作用的平衡关系。大部分先前的研究单纯的认为骨髓腔中的脂肪组织仅仅充当一个填充骨组织管腔的作用,并缺乏造血能力。但是埃尔瓦斯等人在研究中发现骨髓腔中的脂肪细胞对成骨细胞具有脂毒性,体现在脂肪细胞影响成骨细胞的成骨能力和分化能力上,此外,在脂肪细胞和成骨细胞的共培养实验中发现,脂肪细胞释放的游离脂肪酸能抑制成骨细胞的成熟分化,并可诱导成骨凋亡。现存的证据表明骨髓腔中过量的脂肪组织是不利于骨骼系统的,大多数观点认为其是一个重要的负面风险因素。对于老年性的骨质疏松而言,一个理想的治疗策略就是在抑制骨髓腔中骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化成熟的能力的同时增加其向成骨细胞转化的趋势,以此来提高机体骨的形成量。在祖国的传统医药文化中,补骨脂的果实已被广泛运用于补肾壮阳、补脾健胃,其别名又叫破故纸,婆固脂,胡韭子,补骨脂之名取义为“强肾键骨”,古人往往将其使用在骨折或者是骨关节病的治疗中,并且效果显著。临床上补骨脂还运用于治疗皮肤病,心血管病变,肿瘤和哮喘等。异补骨脂素是补骨脂提取物里面主要的有效成分,它和补骨脂素是同分异构体。大量的研究发现补骨脂素有促进成骨细胞分化成熟的能力,与此同时,刺激了骨的形成。仅有少量研究报道异补骨脂素在骨形成过程中的积极作用,但对其促进骨形成的机制却没有进行阐述。另外,我们首先报道了异补骨脂素对骨髓腔中脂肪细胞分化成熟能力的影响及其机制。在本实验中,我们通过对去卵巢的骨质疏松模型小鼠补充异补骨脂素来探讨异补骨脂素在体内对骨髓腔中脂肪细胞分化成熟能力的影响。此外,我们通过体外实验来评价异补骨脂素在成骨诱导和成脂诱导条件下对C57/BL6小鼠的骨髓间充质干细胞分别向成骨细胞和脂肪细胞成熟分化的能力的影响,并且明确了在以上两种过程中细胞学或者是分子生物学的机制。以上的发现可能对临床上治疗骨代谢紊乱提供一条新的思路。目的研究异补骨脂素对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响,以及对核心结合蛋白因子2(RUNX2),过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-y),4E/BP1(Thr37/46)和P-S6(S235/236)表达的影响阐述异补骨脂素影响骨代谢以及抗骨质疏松可能的机制,并通过去卵巢小鼠的体内实验验证我们的结论。方法1.材料和试剂实验用异补骨脂素是从Sigma(分子量,186.1635; St. Louis, MO)公司获得,其异补骨脂素的纯度高于99%,在进行细胞实验时异补骨脂素的溶剂是二甲基亚砜(DMSO; Sigma, St. Louis, MO),储存条件是存于冰箱-20℃C。两月大的C57/BL6雌鼠(SCXK2007-0005; China)由南方医科大学实验动物中心提供,数量为18只。所有的C57/BL6雌鼠被随机平均分为假手术组(sham),去卵巢组(OVX)和去卵巢加异补骨脂素组(OVX+ISO),各组数量6只。去卵巢组(OVX)是单纯切除卵巢,去卵巢加异补骨脂素组(OVX+ISO)是在去卵巢之前5天开始灌胃异补骨脂素,灌胃剂量为20mg/kg/d,灌胃的持续时间为2个月,假手术组(Sham)是在卵巢周围剪去少量脂肪。2.细胞培养小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离至4周大的C57/BL6雌鼠,提取骨髓间充质干细胞(BMSCs)的操作方法来至国外文献报道。小鼠用CO2处死,股骨和胫骨被分离,骨髓腔用眼科剪剪开后用1ML注射器吸取a-MEM(a-MEM; Gibco-BRL, GrandIsland, NY)培养基冲洗骨髓,冲洗至骨头发白即可。分离出的骨髓间充质干细胞(BMSCs)用10%的胎牛血清培养,并在完全培养基中加入青／链霉素双抗(100U/ml of penicillin-streptomycin; Invitrogen, Carlsbad, CA),细胞培养基3天更换1次。骨髓间充质干细胞(BMSCs)种于96孔板和6孔板上进行试验,种植细胞的密度分别为1×104和1×106cells/well。细胞置于5%的C02细胞培养箱中37℃C恒温培养。成熟成骨细胞诱导方案为骨髓间充质干细胞(BMSCs)在6孔的细胞培养板中生长约90%融合时加入成骨细胞诱导培养基(a-MEM细胞培养基含量为85%,胎牛血清含量为15%,青/链霉素双抗比例为1%,100μmol/L的地塞米松,50μg/ml的维生素C磷酸酯,10mM的β-甘油磷酸钠),成骨培养基每3天更换1次。成熟脂肪细胞诱导方案为骨髓间充质干细胞(BMSCs)在培养皿中长满并种于6孔板中。培养至细胞约90%融合以后,骨髓间充质干细胞(BMSCs)用成熟脂肪细胞诱导液开始诱导。在骨髓间充质干细胞(BMSCs)中加入分化液进行诱导,诱导分化液配方为：1μmol/L的地塞米松(Sigma),100μmol/L的吲哚美辛(Sigma)和500μmol/L的异丁基甲基黄嘌呤(IBMX, Sigma),5μg/ml的牛胰岛素(USV)。在开始诱导中需加入异丁基甲基黄嘌呤(IBMX),成熟脂肪细胞诱导培养基更换的时间为每4天更换1次。3.细胞增殖实验原代的骨髓间充质干细胞(BMSCs)种于96孔板中,细胞的种植密度为1×104cells/well,在恒温细胞培养箱中培养2天后对细胞进行加药处理,加入异补骨脂素的浓度分别为0μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/,10μmol/L,100μmol/L1000μmol/L,加药处理时间为48小时,细胞增值实验所使用的试剂盒是Caspase-8比色测定工具包(KeyGEN Biotech, China),操作方法严格按照该产品的使用说明书,细胞的吸收波长为450nm。4.碱性磷酸酶(ALP)染色实验第三代骨髓间充质干细胞(BMSCs)种于6孔板中,在进行成骨诱导时加入异补骨脂素,异补骨脂素的浓度为：0μmol/L,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L培养时间为14天。6孔板中细胞碱性磷酸酶(ALP)活力检测使用碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(Beyotime, China),操作方法严格按照使用说明书。染色步骤为洗去细胞培养基,使用无菌PBS轻柔冲洗2次,每孔均加入2m1的4%多聚甲醛固定20分钟,后用PBS冲洗3次,每次3分钟,以便洗掉多余的多聚甲醛,按照使用说明书配制碱性磷酸酶(ALP)染液,现配现用,配好的碱性磷酸酶(ALP)染液避光保存。细胞清洗后加入碱性磷酸酶(ALP)染液避光37℃C孵育半小时,后用PBS冲洗3遍,以便终止染色,冲洗时间为每遍3分钟。5.油红O染色第三代骨髓间充质干细胞(BMSCs)在成熟脂肪细胞诱导剂和异补骨脂素的作用下诱导,诱导时间为7天后染色和14天后染色,异补骨脂素的浓度为Oμmol/L,5μmol/L,1Oμmol/L,20μmol/L。实验中用油红O染色来发现脂肪细胞在分化成熟过程中累计的脂肪颗粒。经过处理的细胞吸去上清培养基,用高压灭菌的PBS轻柔冲洗2次,后在常温下使用4%的中性多聚甲醛固定,固定时间为15分钟,每个孔里加入2m1的多聚甲醛；用PBS冲洗3次,每次3分钟,去除固定液,每个孔里加入2m1的0.6%(质量／体积)油红O染液,油红O的溶剂为60%异丙醇和40%蒸馏水的混合液,染色时间1小时,染色温度为室温。然后用PBS冲洗细胞3次,每次5分钟,去除多余的油红O染液,最后在培养板中加入lml的异丙醇维持细胞湿润。6.蛋白免疫印迹实验蛋白免疫印迹实验(Western blotting)使用的是SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳系统。在电泳液的环境中每个加样槽中加入20μg的蛋白进行电泳,蛋白溶解于SDS Loading Buffer中。电泳完成后将SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上的蛋白印迹转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,然后加入一抗在摇床上孵育,一抗检测的蛋白有：核心结合蛋白因子2(RUNX2;1:1,000; Abcam),4E/BP1(1:1,000; CST), P-4E/BP1(T37/46)(1:1,000; Santa Cruz), S6(1:1,000; Santa Cruz), P-S6(S235/S236)(1:1,000; Santa Cruz),过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ;1:1,000; Santa Cruz)和p-肌动蛋白(β-actin;1:2500;Abeam)。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在一抗室温孵育1小时后用清洗摇床TBST清洗3次,每次5分钟,然后加入有辣根过氧化物酶标记的二抗,二抗室温孵育1小时,之后用TBST在清洗摇床上清洗3次,每次5分钟。最后在暗室中使用荧光发光试剂显色和胶片曝光,曝光完毕后使用机器冲洗出蛋白免疫印迹的底片。7.显微CT (μCT)分析对股骨远端进行显微CT ((Scanco Medical; μCT80)分析,小鼠使用C02麻醉。股骨下端骨小梁较为明显和集中的区域通过显微CT (μCT)分析和三维重建,设置的参数为：扫描电压70KV,功率为30W,扫描电流为4291μA,每次扫描厚度为5μm。我们分析数据包括以下几个方面：骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁体积(Tb.Sp)、骨体积(BV)/总体积(TV)和骨小梁数量(Tb.N)。8.免疫荧光和显微镜使用骨髓间充质干细胞(BMSCs)爬片是用胶原处理过得载玻片,用无菌PBS柔冲洗2次,4%中性多聚甲醛在室温下固定15分钟,PBST冲洗3次去除多余的多聚甲醛,PBST的含量比例为每500m1的PBS中加入500μl吐温-20(Twen-20),0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)在室温下孵育5分钟进行破膜作用,甩掉多余的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100),之后加入一抗进行孵育,一抗检测的蛋白有核心结合蛋白因子2(RUNX2;1:100; Abcam),过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ;1:50; Santa Cruz),去除一抗后用PBST清洗3次。然后用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔免疫球蛋白(1：500；Sigma)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的山羊抗鼠免疫球蛋白(1：500；Sigma)在室温情况下避光孵育1小时,然后用PBST清洗3次。最后用含有DEPI的封片剂封片3分钟后在荧光显微镜下观察和拍照。股骨的免疫荧光操作方法和细胞爬片的操作步骤相似,不同的是股骨石蜡切片在脱蜡至水以后用0.2mg/ml的蛋白酶K (proteinase K)进行抗原修复,股骨切片厚度为2μm,修复时间为10分钟,修复温度为37℃C。此后去除蛋白酶K (proteinase K) PBST清洗3次,紧接细胞爬片免疫荧光染色的0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX100)孵育及其以后的步骤。细胞和股骨切片的免疫荧光使用荧光共聚焦显微镜(Olympus;FV1000)拍摄。9.骨髓腔中脂肪细胞分析本实验对股骨远端的骨髓腔进行了脂肪细胞定量分析,本实验经历了固定、脱钙、脱水、石蜡包埋、切片、染色、拍照和软件定量分析。用普通光学显微镜(Olypus, BX51)拍照,拍摄部位为股骨下段干骺端,定量脂肪细胞,分析参数为：脂肪细胞数量(AD#, per mm2),总脂肪细胞面积占骨髓腔的比例(AV/TV)。所有切片均由不同的三个人统一拍摄同一区域,拍摄顺序由图片左下角干骺端向右将图片平均分割呈三个区域进行拍摄,然后从图片左上角皮质骨内向右将图片分割成三个区域进行拍摄,在进行脂肪细胞计数时不包括已被破坏的脂肪细胞。在分析时为避免对最终结果产生偏倚,所有图片进行分析时均未知标本的各自分组(Sham, OVX或者OVX+ISO组),所有图片均在20倍显微镜镜头下拍摄。10.数据分析采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。结果以均数±标准差表示,采用单因素方差分析。首先进行方差齐性检验,若检测结果方差齐性,则组间多重比较采用LSD法；若方差不齐则采用组间多重比较Dunnett’sT3法。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.细胞增殖实验小鼠的原代骨髓间充质干细胞(BMSCs)经过异补骨脂素加药处理后检测Caspase-8分光光度法检测试剂盒(CCK8)检测加药的浓度依次为：0μmol/L,0.1μmol/L,1μmol/L,10μmol/L,100μmol/L,1000μmol/L。实验结果表明异补骨脂素浓度在1～100μmol/L之间处理48小时后对原代细胞的增殖无影响。2.体外碱性磷酸酶(ALP)染色实验为确定异补骨脂素是否对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,我们进行了碱性磷酸酶(ALP)染色。碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分化时重要的标记蛋白。研究发现异补骨脂素促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,并且促进作用呈浓度依赖性,成骨诱导14天时,20μmol/L浓度的异补骨脂素对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的促进作用最大。以上结果说明异补骨脂素能明显促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。3.油红O染色实验异补骨脂素抑制小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成熟脂肪细胞分化,抑制作用呈浓度依赖性。在异补骨脂素加药处理的同时进行成熟脂肪细胞诱导7天后,我们发现经过油红O染色后,脂肪细胞包浆中的脂滴数量明显减少。成脂诱导14天后,20μmol/L的异补骨脂素成脂率最低。实验结果显示异补骨脂素抑制小鼠骨髓间充质干细胞向成熟脂肪细胞分化。4.显微CT (Micro-CT)扫描C57/BL6雌鼠经过去卵巢手术饲养2月后,小鼠股骨下端的骨量(BV)明显下降,而异补骨脂素灌胃治疗能明显逆转去卵巢手术后的骨量丢失。去卵巢手术组和假手术组相比,股骨下端骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分离度(Tb.Sp)均明显下降,经过2月的异补骨脂素灌胃治疗后,去卵巢手术组的小鼠以上两个指标均得到明显改善。5.骨组织形态学检测去卵巢手术组(OVX)和去卵巢加异补骨脂素组(OVX+ISO)的股骨下端苏木素伊红(HE)染色图像提示去卵巢手术处理后,股骨下端骨小梁丢失明显,而灌胃异补骨脂素后能明显降低由于去卵巢引起的骨质损害。更重要的是,和单纯去卵巢的手术组(OVX)相比,去卵巢手术加药组(OVX+ISO)的骨髓腔中脂肪细胞明显减少。因此我们认为,异补骨脂素能抑制雌鼠由于去卵巢引起的股骨下端骨小梁丢失,而且这种对骨的保护作用其中的机制不排除通过抑制骨髓腔中骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成熟脂肪细胞转化来实现。6.核心结合蛋白因子2(RUNX2)的体内免疫荧光实验核心结合蛋白因子2(RUNX2)在成骨细胞的分化成熟过程中广泛表达,对于骨的重建和功能的实现起着非常重要的作用。我们通过核心结合蛋白因子2(RUNX2)的免疫荧光染色发现,着色区域主要集中在成骨细胞中,即广泛出现在骨陷窝表面,在去卵巢手术组(OVX)中,核心结合蛋白因子2(RUNX2)的染色荧光强度降低,着色区域明显减少。而在去卵巢灌胃异补骨脂素组(OVX+ISO)中,荧光着色区域明显增加,荧光强度也明显增强。以上的差异通过统计学分析显示有统计学意义。7.过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的体内免疫荧光实验去卵巢灌胃异补骨脂素组(OVX+ISO)中,过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-y)的表达是明显下降的,而过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达在骨表面也被大量发现,传统意义上,脂肪细胞的分化成熟是离不开过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的存在,以上信息提示异补骨脂素可能通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)实现对骨髓腔中脂肪细胞分化成熟过程的抑制。8.核心结合蛋白因子2(RUNX2),过氧化物酶体增殖物激活受体Y(PPAR-γ), S6, P-S6(S235/236),4E/BP1, P-4E/BP1(T37/46)的体外蛋白免疫印迹实验为了确定异补骨脂素是否对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外分化产生影响,我们进行核心结合蛋白因子2(RUNX2),过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ), S6, P-S6(S235/236),4E/BP1, P-4E/BP1(T37/46)的体外蛋白免疫印迹实验。异补骨脂素促进小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞成熟分化,并上调了小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中核心结合蛋白因子2(RUNX2)的表达,核心结合蛋白因子2(RUNX2)是成骨细胞特异性蛋白标记物,这种促进小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中核心结合蛋白因子2(RUNX2)的表达呈浓度依赖性,小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在成骨诱导的同时加入异补骨脂素,培养14天后发现20μmol/L的异补骨脂素核心结合蛋白因子2(RUNX2)表达最强。对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行成脂诱导并加入异补骨脂素培养7天,发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中表达明显下降,且下降呈浓度依赖性。同样在成脂诱导并加入异补骨脂素14天时,抑制趋势呈浓度依赖性,对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)最大抑制时异补骨脂素的浓度为20μmol/L。为了探索异补骨脂素抑制小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向脂肪细胞分化并促进小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的机制,我们检测了哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路上的一些重要蛋白。研究中发现小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行成骨诱导并加入异补骨脂素14天后,P-S6(S235/236)是明显下降的,且异补骨脂素浓度为20μmol/L时最低,而4E/BP1(Thr37/46)的表达明显上升,在异补骨脂素浓度为0的时候表达是最低的,且呈浓度依赖性。在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行成脂诱导并加入异补骨脂素时,7天和14天时间点上P-S6(S235/236)的表达都是明显上升的,P-S6(S235/236)表达的最低点出现在异补骨脂素浓度为0时,而4E/BP1(Thr37/46)的表达随异补骨脂素浓度的升高明显下降,4E/BP1(T37/46)的表达最低点出现在异补骨脂素浓度为20μmol/L o以上信息提示我们异补骨脂素可通过调控小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路上的一些重要蛋白表达来实现其生物学功能。结论目前实验结果表明,异补骨脂素从细胞和组织水平通过抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达,并促进核心结合蛋白因子2(RUNX2)的表达,来促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化,而不是向脂肪细胞分化,进而减少骨髓腔中脂肪细胞的量,另外,我们认为mTORl信号通路也参与了该作用机制。