雷公藤HMGR基因克隆、表达及调控萜类次生代谢的初步探究

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雷公藤为我国传统中药之一,具有良好的杀虫活性及医用价值。但是雷公藤化学成分复杂,且某些生物活性物质含量低微,至今仍不能通过化学合成、提取的方法大量获得。加之,雷公藤野生资源在各地分布不均,及人类对自然资源的破坏,致使雷公藤野生资源面临枯竭,基于以上因素使得雷公藤的应用受限。本研究以雷公藤为材料,利用RT-PCR及RACE技术克隆得到3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因(HMGR)全长cDNA序列,并对其进行生物信息学和诱导表达分析。根据GeneBank中报道的HMGR的编码基因序列合成简并引物,采用RT-PCR、5’-RACE和3’-RACE方法从雷公藤叶片获得编码HMGR基因的cDNA,在雷公藤中该基因全长序列为1909bp,包括98bp的5’上游序列,50bp的3’序列,该序列以poly A结尾,开放阅读框1860bp,编码579个氨基酸。生物信息学分析显示雷公藤HMGR基因编码的蛋白分子量为61.678KDa,等电点为6.98,蛋白质稳定性参数为41.33,为不稳定蛋白质,具有两个跨膜结构域,由位于A29~A51和A71~A93的残基组成;亚细胞定位于质膜;该蛋白是一种疏水性蛋白,包含两个与NADPH结合的位点(DAMGMNM和VGTVGGGT),两个与HMG-CoA结合的位点(EMPVGYVQIP和TTEGCLVA),其中TTEGCLVA中的G在HMGR催化中起着重要作用。氨基酸多重序列比对结果显示雷公藤HMGR与其他植物的HMGR有较高同源性。二级结构由43.35%的a-螺旋、17.10%的延伸链、5.01%的β-转角、34.54%的无规卷曲组成;其三维空间构象呈“V”型。进化树分析表明,雷公藤HMGR与龙眼、荔枝的HMGR亲缘关系最近。通过半定量RT-PCR分析HMGR在根、茎悬浮细胞、叶组织中的表达情况。结果表明,雷公藤HMGR基因为组成型表达,且叶中表达最强。采用HPLC技术及RT-PCR的方法,分析了不同浓度壳寡糖处理雷公藤悬浮细胞后萜类物质合成相关基因HMGR的表达特性以及HMGR的差异表达与萜类物质积累的相关性。壳寡糖诱导实验表明,雷公藤HMGR在悬浮细胞中受到壳寡糖的诱导。半定量RT-PCR结果表明,经50mg/L壳寡糖诱导12h雷公藤叶悬浮细胞中HMGR基因表达最强,而且在该诱导条件下雷公藤叶悬浮细胞雷公藤吉碱、次碱和内酯醇的含量与对照相比也存在显著差异(p<0.05)。研究结果初步表明,雷公藤HMGR可能调控着萜类物质的合成代谢。所得结果为阐述雷公藤萜类物质的生物合成机理及提高雷公藤萜类物质含量奠定了基础。
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