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研究背景:
糖尿病(Diabetes melintus,DM)已成为威胁人类健康的一大类疾病,其发病率逐年增加,发病年龄日趋年轻化。DM患者晚期常死于各类并发症,其中大血管和微血管病变是致死、致残的主要原因。已有研究表明,内皮细胞功能的异常变化在糖尿病血管病变过程中发挥了关键作用。
血管内皮通过释放舒张和收缩因子调节血管的基础张力以及生理、病理状态下血管对机械张力和神经递质的反应性,在血管功能的调节过程中发挥了重要作用。其中,由内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)生成的NO是调控血管舒张反应的最重要因素。而且,越来越多的证据表明,NO不仅参与血管张力的调节,还具有抑制血小板聚集,降低内皮细胞的通透性,抑制单核细胞和白细胞与内皮细胞的黏附以及抑制平滑肌细胞增殖和迁移等功能,说明eNOS/NO通路在维持心血管稳态中发挥了重要作用。
大量的动物实验和临床观察发现,血管内皮依赖性舒张反应降低是糖尿病发病早期的标志性变化。尽管糖尿病内皮功能损害是多因素综合作用的结果,但eNOS/NO通路的异常是导致内皮损害最主要的原因。在血管内皮细胞,NO的合成依赖于eNOS的活性和表达水平。因此,深入探讨糖尿病发病过程中eNOS的活性和表达异常变化的机制,对寻找防治糖尿病血管合并症的新靶点具有重要意义。
MicroRNA是最近发现的一类内源性保守非编码RNA小分子,大小约22个核苷酸左右,它通过与目标mRNA3端非翻译区配对降解mRNA或抑制mRNA的翻译,从转录后水平沉默基因的表达。近期大量研究报导了MicroRNA广泛参与了糖尿病相关过程的调控,包括胰岛素分泌、胰腺发育、β细胞分化,糖代谢、脂代谢等。在血管内皮细胞,已往研究表明MicroRNA参与调控了细胞的多种功能,如血管生成和炎症反应等。但microRNA是否参与调控糖尿病内皮功能障碍和血管合并症的发生,尚不清楚。miR-155位于非编码基因Bic内,在血液细胞中高表达。已有研究表明miR-155参与调控T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突状细胞的分化,从而影响机体的免疫功能。最近有研究发现,miR-155在内皮细胞有表达,可溶性CD40分子和TNFα可上调其表达,但其在内皮细胞中的功能尚未见报道。
目的:
本课题拟在阐明糖尿病发病过程中eNOS/NO信号通路和miR-155表达是否有异常变化的基础上,进一步分析miR-155的表达异常对eNOS的调控作用及其机制。拟从microRNA这一新的角度寻找防治糖尿病血管合并症的新靶点。
方法:
1.STZ腹腔注射雄性Wistar大鼠诱导糖尿病模型,观察4周糖尿病大鼠与正常大鼠主动脉对乙酰胆碱和硝普钠引起的血管舒张反应的差异。
2.Western blot和实时荧光定量RT-PCR检测4周糖尿病大鼠和对照组两组之间eNOS蛋白和mRNA表达的差异。
3.检测高糖对HUVEC eNOS蛋白、mRNA表达以及eNOS活性和NO生成的影响。
4.放线菌素D处理抑制HUVEC转录,荧光实时定量RT-PCR观察高糖不同时程后eNOS mRNA稳定性的变化。
5.荧光实时定量RT-PCR检测高糖对miR-155表达的变化。
6.pCDNA3-eNOS-3UTR和pCS2-miR155质粒共转染cos7细胞,Western blot检测pCS2-miR155对外源eNOS表达的影响。
7.Luc-eNOS-3UTR质粒与pCS2-miR155共转染cos7细胞24h,测定pCS2-miR155对荧光素酶活性的影响。
8.Western blot检测ad-miR155腺病毒载体转染对HUVEC内源性eNOS表达的影响。
9.放线菌素D抑制HUVEC转录后,荧光实时定量RT-PCR检测ad-miR155转染组与对照组之间eNOS mRNA表达的差异。
结果:
1.糖尿病组大鼠乙酰胆碱引起的主动脉血管舒张反应与正常对照组相比显著降低,而硝普钠引起的血管舒张反应在两组间无明显差异。反映糖尿病时内皮依赖性血管舒张反应降低,而非内皮依赖性的舒张反应无变化,提示eNOS/NO信号通路存在异常。
2.糖尿病大鼠主动脉eNOS蛋白和mRNA表达均明显低于对照组,提示eNOS的表达变化参与了糖尿病内皮功能障碍。
3.高糖处理人脐静脉内皮细胞24h后,eNOS蛋白和mRNA表达水平显著降低,同时eNOS的活性亦明显下降。提示高糖环境可通过抑制eNOS的转录和翻译,进而降低eNOS的活性,减少NO的生成。
4.转录抑制剂actinomycin D处理人脐静脉内皮细胞后,随高糖作用时间的增加,eNOS mRNA降解加快,半衰期降低。提示高糖环境可促进eNOS mRNA的降解,降低eNOS mRNA稳定性。
5.高糖处理人脐静脉内皮细胞1h后,miR-155表达即开始增高,4h达到最大效应。
6.Cos7细胞共转染pCS2-miR155和pcDNA3-eNOS-3UTR质粒后,western blot结果显示miR155可剂量依赖性降低eNOS表达。
7.在Cos7细胞,pCS2-miR155转染后可剂量依赖性降低含3端非翻译区的eNOS报告基因荧光素酶的表达活性。
8.在人脐静脉内皮细胞,miR155转染可促进eNOS mRNA的降解,进而剂量依赖性抑制内源性eNOS表达。
结论:
1.糖尿病血管内皮依赖性舒张反应降低,其机制与eNOS表达下降有关。
2.高糖环境可促进eNOSmRNA的降解,进而导致eNOS表达降低,NO合成减少。
3.高糖环境可促进miR155的表达。
4.miR155通过直接结合到eNOS mRNA3端非翻译区,促进eNOS mRNA的降解,进而抑制eNOS蛋白的表达和NO生成减少。