缺血性脑卒中是中老年人致死致残的主要疾病之一,目前尚无有效药物能够阻止脑缺血和再灌注损伤引起的多重神经损害。许多动物实验表明,骨髓间质干细胞(MSCs)经全身或局部移植后能促进卒中后神经功能的修复。在大鼠脑卒中和创伤模型中,经静脉或大脑内直接注射MSCs后,MSCs可穿过血脑屏障向损伤脑组织聚集,进而修复神经功能。其中,损伤组织似乎可特异吸引MSCs向损伤区迁移,然而,目前对调节MSCs迁移进而向损伤脑组织聚集的机制还不清楚。已知基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)和其唯一特异受体CXCR4与干细胞定向迁移和损伤修复密切相关。在大鼠心肌梗死模型中,SDF-1在促使表达CXCR4的MSCs向缺血心肌的定向迁移、聚集中起很重要作用。而SDF-1α/CXCR4在低氧条件下表达增加,如急性肾衰、缺血性心脏病、脑缺血。为此,推测SDF-1α/CXCR4在MSCs向缺血脑组织的定向迁移中可能也起很重要作用。RNA干扰(RNAi)技术可稳定沉默哺乳动物细胞内的靶向基因,是研究基因功能的强大工具。为探讨脑缺血损伤中MSCs的迁移和调节机制,我们首先构建CXCR4 RNAi慢病毒载体,进而建立CXCR4基因稳定沉默的大鼠MSCs(rMSCs)。随后通过体内、外实验研究CXCR4基因沉默和SDF-1α对rMSCs迁移的影响。本课题分三部分。第一部分:CXCR4基因RNAi慢病毒载体的构建及鉴定1、材料和方法1)根据大鼠CXCR4 mRNA序列,选择三个21nts的靶序列,设计并合成包含各正、反义靶序列的互补DNA链;2)退火后插入pSUPER载体的H1 RNA启动子后面,产生pRiCXCR4a, b, c;3)酶切电泳和测序鉴定;4)质粒鉴定正确后,将其中的CXCR4 shRNA表达结构酶切,插入到慢病毒载体质粒pNL中,产生pNL-RiCXCR4a, b, c。2、结果1)酶切鉴定和测序都证实pRiCXCR4质粒构建正确。2)将pRiCXCR4中的CXCR4 shRNA表达结构插入pNL质粒,产生能同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和转录产生CXCR4 shRNA的慢病毒载体质粒,测序鉴定正确。3、结论1)成功构建大鼠CXCR4 shRNA表达载体pRiCXCR4。2)成功构建大鼠CXCR4基因RNAi慢病毒载体pNL-RiCXCR4。3)为通过阻断大鼠CXCR4基因表达进而研究CXCR4功能奠定了基础。第二部分:CXCR4基因沉默的骨髓间质干细胞的构建、培养与鉴定1、材料和方法1)将三质粒pNL-RiCXCR4、pHELPER和pVSVG共转染293T细胞,包装生产慢病毒;2)经超速离心收集病毒颗粒,转导293T细胞,用流式细胞术测定EGFP蛋白表达率来测定慢病毒功能滴度;3)用相同滴度的慢病毒转导rMSCs ,建立CXCR4基因稳定沉默细胞系rMSCs/pNL-RiCXCR4(MSC-CXCR4-);4)用实时定量RT-PCR、Western Blot和流式细胞术检测CXCR4 mRNA、蛋白质和细胞表面表达水平,筛选有效的CXCR4基因沉默的细胞系MSC-CXCR4-;5)绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间,比较CXCR4基因沉默的rMSCs与亲本细胞的生长变化。2、结果1)三质粒pNL-RiCXCR4、pHELPER和pVSVG共转染293T细胞,包装产生慢病毒。2)未浓缩含病毒细胞培养上清和浓缩病毒悬液的功能滴度分别为6.4×104TU/mL和6.9×106TU/mL。3) CXCR4基因稳定沉默细胞MSC-CXCR4-强烈表达EGFP。4)实时定量RT-PCR、Western Blot和流式细胞术一致证实pNL-RiCXCR4b组的CXCR4抑制作用最显著。5)亲本细胞、非特异细胞和CXCR4基因沉默细胞的生长曲线和倍增时间无明显差异。3、结论1)包装产生高滴度慢病毒,并能高效转导rMSCs。2)建立CXCR4基因稳定沉默细胞系MSC-CXCR4-。3)实时定量RT-PCR分析CXCR4 mRNA、Western Blot检测CXCR4蛋白和流式细胞术检测rMSCs表面CXCR4抗原,均证实所构建的慢病毒载体能使rMSCs的CXCR4基因表达显著下调。4)细胞生长曲线测定实验证明,CXCR4基因沉默rMSCs的生长未受到明显影响。第三部分:CXCR4基因沉默及SDF-1α对骨髓间质干细胞迁移作用的体内、外实验研究1、材料和方法1)体外实验在内置8μm孔径聚碳酸酯膜的48孔微迁移板中进行,趋化因子SDF-1α以不同浓度加入到迁移板下室,细胞rMSCs或CXCR4基因沉默的rMSCs加入到上室,观察细胞迁移情况,计算细胞迁移指数。2)取健康成年雄性SD大鼠制作短暂大脑中动脉阻塞(MCAO)模型。在MCAO前24h或MCAO后24h将表达EGFP(EGFP+)的rMSCs经股静脉移植入大鼠体内。其中,EGFP+的CXCR4基因沉默的rMSCs仅移植入MCAO后24h的大鼠体内。3)将EGFP阳性(EGFP+)的rMSCs经股静脉移植入正常大鼠体内后,立即将SDF-1α直接注射入左侧大脑皮质。作为对照,对侧相应部位只注射PBS。4)取大鼠骨髓制作涂片,同时取脑、心、肺、肝、脾、肾、骨骼肌、小肠组织标本制作冰冻切片,在荧光显微镜下观察EGFP+细胞的分布情况。5)为明确脑组织中SDF-1α表达和EGFP+细胞迁移之间的定位关系,对脑组织冰冻切片进行SDF-1α的免疫荧光染色。2、结果1)体外微迁移板实验表明,加入200ng/mL SDF-1α后可明显促进rMSCs的跨膜迁移,而rMSCs中CXCR4基因沉默后,rMSCs的跨膜迁移明显减弱。2)对MCAO前大鼠或对未进行MCAO的正常大鼠移植EGFP+细胞后,可在其肺、骨髓、脾、小肠发现EGFP+细胞,而在其他组织未发现。3)对MCAO后大鼠移植EGFP+细胞后,发现大量EGFP+细胞聚集于大脑半球缺血半暗带区,在肺中也可见EGFP+细胞分布,在缺血对侧大脑半球及其他组织中未发现。而rMSCs中CXCR4基因沉默后,这种EGFP+细胞在大脑半球缺血区的聚集作用被明显抑制。4)免疫荧光染色显示,在脑组织切片中SDF-1α主要由缺血半暗带区神经元和星形胶质细胞分泌,EGFP+细胞的数量和定位与SDF-1α的表达量大体一致。3、结论1)移植前的脑组织急性损伤对移植的rMSCs向脑局部缺血损伤区定向迁移起决定性作用,否则移植细胞将在骨髓和脾脏较长时间停留且不易再次迁移。2)损伤脑组织局部产生的SDF-1α和表达于rMSCs表面的CXCR4在介导rMSCs的损伤组织定向迁移中起很重要作用,在MSCs移植治疗脑梗死中,我们可能可通过调节SDF-1α/CXCR4表达以达到增进治疗作用的目的。