论文部分内容阅读
猪圆环病毒4型（Porcine circovirus type 4,PCV4）作为一种新发现的猪圆环病毒,于2019年在我国湖南省的猪群中首次被检测到,由于发现时间较短,对其流行情况和致病性等相关信息还不明确。对收集的2016年至2018年内蒙古自治区51个猪场的1683份猪血清样本进行了 PCV4回溯性检测,PCR检测结果表明PCV4在猪群中总阳性率为1.6%（27/1683）,PCV4在猪场水平的阳性率为21.6%（11/51）。其中,2016年PCV4在猪群中总阳性率为0.2%（1/485）,2017年为1.7%（12/686）,2018年为2.7%（14/512）;2016年PCV4在猪场水平的阳性率为6.7%（1/15）,2017年为25%（5/20）,2018年为31.3%（5/16）,表明PCV4感染率呈现逐年上升趋势。此外,对PCV2、PCV3、PCV4的共感染情况进行了探究,结果表明PCV4感染与PCV2和PCV3感染并不相关。为明确PCV4的遗传变异和进化规律,本研究共获得了 3条PCV4全基因组序列,同源性分析表明,PCV4具有较高的遗传稳定性。同时,将目前NCBI所能下载到的8条PCV4序列与17种圆环病毒的23条完整基因组序列进行比对,通过核苷酸和推导的氨基酸序列同源性的分析表明,PCV4与水貂圆环病毒同源性最高。PCV4遗传多样性分析结果显示,Cap蛋白序列中存在7个氨基酸突变,Rep蛋白序列中存在6个氨基酸突变;ORF1基因中有19个核苷酸变异位点,ORF2基因中有17个核苷酸变异位点,但没有任何插入和缺失。分别对PCV4全基因组序列、Cap基因序列、Rep基因序列进行系统发育分析,结果显示,PCV4处于一个独立的分支中,与水貂圆环病毒具有最为密切的进化关系。以本实验室扩增的内蒙PCV4毒株的ORF2基因序列为参考,对其密码子进行优化并送往公司进行质粒合成,通过设计特异性引物,扩增出截短后的Cap蛋白基因。将目的基因克隆至pET-28a载体,构建pET28a-PCV4-Cap重组表达质粒。将重组质粒转化至表达宿主菌BL21（DE3）pLysS中进行诱导表达,制备PCV4 Cap重组蛋白。通过优化表达的条件,经SDS-PAGE分析,Cap重组蛋白能够在沉淀中大量表达,且在IPTG终浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导6h条件下表达量最高,其大小约为27 kDa。经Western blot验证,条带单一,与预期结果相同。采用亲和层析的方法,通过镍柱对带有His标签的pET28a-PCV4-Cap重组蛋白进行纯化,纯化后目的蛋白最高纯度可达95.16%。使用纯化、复性后的pET28a-PCV4-Cap重组蛋白与弗氏佐剂按照1:1的比例,乳化后注射于4至6周龄的Balb/c小鼠,制备鼠源多克隆抗体,抗体效价可达1:300000以上。以纯化、复性后重组蛋白作为包被抗原,建立PCV4间接ELISA检测方法,通过对各反应条件进行优化,最终确定:抗原最佳包被浓度为1 μg/mL,4℃包被过夜;使用5%BSA,37℃封闭1 h为最佳封闭条件;待检血清最佳稀释倍数为1:400,37℃孵育1 h;酶标二抗最佳稀释浓度为1:5(000,37℃孵育15 min;底物最佳显色条件为室温显色1 5 min。本研究所建立间接ELISA检测方法批间与批内重复性试验变异系数均小于10%,且与PCV2、PRRSV、PRV、SVV阳性血清不产生血清学交叉反应,证明该方法重复性与特异性良好,为PCV4血清流行病学快速检测提供了新的途径。