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一、背景和目的脑胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的肿瘤,胶质母细胞瘤是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤,五年生存率大约于9.8%。近年来,胶质瘤干细胞(GSCs)被认为是胶质瘤细胞中的一个重要亚群,GSCs是具有增殖和分化潜能的一群细胞,具有自我更新复制的能力和多向分化的能力。许多研究表明,GSCs在胶质瘤中仅占不到1%的比例,而却被认为与胶质瘤的高度异质性、胶质瘤的复发密切相关。在胶质瘤干细胞分子标志物的研究中,CD133被普遍认为是胶质瘤干细胞的“干性”标志物,越来越多的研究开始针对CD133+的胶质瘤干细胞探讨靶向药物对胶质瘤的治疗效果。但研究的不够深入,在GSCs中存在一群CD133-的“干样”肿瘤细胞,同样在肿瘤的发展侵袭中起着重要作用。其中A2B5+的“干样”肿瘤细胞同样有CD133+干细胞相近的生物学特性。A2B5是少枝-II型星形胶质细胞祖细胞的标志物,少枝-II型星形胶质细胞祖细胞可分化为少枝胶质细胞或II型星形胶质细胞。近年来的部分研究表明A2B5也是一种干细胞的标志物,A2B5+的这一群细胞甚至可以认为是胶质瘤细胞的部分起源。从胶质瘤中分选出A2B5+的胶质瘤干样细胞球也表达nestin等干性标志物,并可以分化出神经元细胞,星形胶质细胞和少突胶质细胞。在本研究中,我们通过改进细胞建株技术,通过分选纯化-单克隆法从实体肿瘤中获取A2B5+/CD133-的这一群胶质瘤“干样”细胞亚群,并希望通过这一方法可以稳定、高效、大量的从肿瘤组织中获取A2B5+/CD133-的胶质瘤干样细胞。适应针对A2B5+/CD133-的胶质瘤的靶向药物研究的需要,为胶质瘤干细胞的研究提供实验工具。二、材料和方法1、临床组织样本2、免疫组化检测胶质瘤相关蛋白在临床组织样本中的表达。3、原代培养、分选纯化-单克隆法建立A2B5+/CD133-干样细胞株SHG-ZWs、细胞免疫荧光检测A2B5蛋白表达率。4、MTT实验、流式细胞检测细胞增殖、细胞周期。5、二次成球实验、免疫荧光实验、多向分化实验检测SHG-ZWs细胞干性。6、裸小鼠原位移植瘤模型检测SHG-ZWs细胞成瘤性。三、结果1、脑胶质瘤患者的临床影像学和病理资料本例脑肿瘤患者头颅CT诊断为左颞顶叶复发胶质瘤,术后病理为胶质母细胞瘤。组织学检查表现出明显的核异型性,肿瘤细胞的直径变化大,核分裂和核不规则多见,胞浆丰富呈现为“裸核样细胞”。高度增殖的肿瘤细胞小而圆,伴有单核或多核瘤巨细胞。免疫组化显示:GFAP(+)、S-100(+)、vimentin(+)、Ki-67(65%),A2B5(-)、EGFR(+)、MGMT(+)、p53(+)、Nestin(+)。2、人源胶质瘤细胞SHG-140的原代培养及SHG-ZW细胞株的克隆肿瘤组织块经原代培养获得SHG-140细胞系,在10代后生长迅速,传至20代后使用免疫磁珠分选出A2B5+的细胞亚群,在通过有限稀释法对这一亚群的细胞进行单细胞克隆,稳定传代得到了至20代的A2B5+的细胞株命名为SHG-ZW。SHG-ZW细胞呈贴壁生长,胞核大胞质少,核内不均匀性,核分裂像多见,染色质增加。免疫荧光染色显示第20代SHG-140细胞系与第20代SHG-ZW细胞株的相关分子表型特征,免疫荧光染色显示:在SHG-140细胞系中含有多种亚群的细胞,分子病理特征相对混杂,表现出较高的增殖指数GFAP(+)vimentin(+)S-100(+)VEGF(+)Ki-67(52%);而从SHG-ZW细胞株的细胞免疫荧光结果可见,SHG-ZW细胞株是由单个亲代细胞克隆而获得的子代细胞群,在20代表现出GFAP(-)A2B5(+)vimentin(+)s-100(+)VEGF(+)Ki67(48%)。3、人脑胶质瘤细胞SHG-ZW的增殖速度和细胞周期第20代SHG-ZW细胞消化重悬后,以血球计数仪计数2x107个种植于10mm培养皿中,SHG-ZW细胞在48小时内增殖迅速,在96小时后增长逐渐变缓慢,在120小时后达到生长平台期。取第20代生长第2天的SHG-ZW细胞经流式细胞检测分析细胞周期,G1期、S期和G2期细胞比例分别为75.08%,8.40%,16.11%。4、SHG-ZW细胞转化成SHG-ZWs细胞及其细胞周期分析第20代SHG-ZW细胞在NSCM中培养2周后见干细胞样球体,悬浮生长。传至第6代,可见大量SHG-ZWs细胞悬浮生长。SHG-ZWs细胞的G1期、S期和G2期细胞比例分别为42.65%,12.65%和45.47%。SHG-ZWs细胞二次球体形成率为97.6%,培养21d后球体平均直径达到220μm。5.SHG-ZWs细胞的分子表型特点取第10代SHG-ZWs细胞进行免疫荧光细胞化学检测,其中SOX2(+),nestin(+),nanog(+),CD133阳性比例为(4.20±1.29)%,A2B5阳性比例为(84.12±9.96)%,表明SHG-ZWs为A2B5+CD133-GSCs亚群细胞。6.SHG-ZWs细胞的多向分化潜能:诱导分化SHG-ZWs细胞1d后,可见以干细胞球为中心向外贴壁生长的大量细胞。细胞免疫荧光结果显示,贴壁细胞中vimentin、Gal C、GFAP、NSE的阳性比例分别为、43.4%、29.6%、86.1%、6.8%,表明了SHG-ZWs干细胞具有多向分化的能力。7.SHG-ZW和SHG-ZWs细胞颅内原位移植瘤模型的建立与分子病理特性SHG-ZW和SHG-ZWs细胞颅内原位移植瘤的细胞形态及核异型性相似,但SHG-ZW细胞颅内原位移植瘤生长速度快,形成的肿瘤体积大呈膨胀性生长,有相对性清晰的肿瘤边界,肿瘤细胞成分多样,而SHG-ZWs细胞颅内原位移植瘤生长相对缓慢,形成的肿瘤体积小呈侵润性生长,肿瘤无明显边界,瘤内及瘤周血管更丰富,远处播散更为明显。免疫荧光显示,GFAP(+)vimentin(+)A2B5(+)EGFR(+)。四、结论本研究表明可通过分选纯化-单克隆法从实体肿瘤中建立稳定传代的A2B5+/CD133-胶质瘤干细胞株,为胶质瘤干细胞异质性及多样性的研究以及对人源GBM肿瘤组织原代培养,为胶质瘤干细胞的靶向性治疗提供细胞工具。