实验目的:1.利用小鼠胚胎成纤维细胞建立小鼠诱导多能干细胞株（mouse induced pluripotent stem cells,mi PSCs）,并确定ROCK抑制剂对细胞重编程速率以及效率的影响。2.探究ROCK抑制剂对小鼠诱导多能干细胞株维持培养的作用。3.在体外将小鼠诱导多能干细胞定向分化为乳腺类器官,构建用于探索乳腺癌发生机制的模型。实验方法:首先利用已经成功构建的OG2-OSKM转基因小鼠提取的胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts,MEF）作为体细胞来源,通过添加强力霉素（Doxycycline,Dox）启动内源Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四个转录因子表达,从而诱导细胞重编程。在诱导过程中加入抑制Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil containing kinase,ROCK）活性的小分子抑制剂Y27632,密切观察细胞形态和Oct4-GFP报告基因表达所产生的荧光,记录出现克隆的日期,并利用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AP）染色检测细胞多能性,通过统计比较产生的诱导多能干细胞阳性克隆数量确定ROCK抑制剂对细胞重编程的影响。其次,挑选GFP阳性细胞单克隆接种在丝裂霉素C（Mitomycin C,MMC）处理后的C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞上,即饲养层细胞（feeder layer cells）,并使用小鼠胚胎干细胞完全培养基（Embryonic Stem cells Medium,ESM）进行传代培养,建立小鼠诱导多能干细胞株。在培养过程中加入ROCK抑制剂,通过观察比较克隆的数量、体积、荧光强度以及碱性磷酸酶染色后的颜色深度,确定ROCK抑制剂对诱导多能干细胞传代效率的影响。最后利用Western Blot检测细胞中Oct4、c-Myc和Nanog等多能标记基因（marker）的蛋白表达水平变化,揭示抑制ROCK活性对维持小鼠诱导多能干细胞多能性的影响。最后,利用建立的小鼠诱导多能干细胞株经过定向分化构建小鼠乳腺类器官。第一步,采用悬浮培养方式诱导细胞分化为非神经外胚层类胚体,并使用Mammo Cult完全培养基富集具有分化为各种乳腺细胞潜能的乳腺干细胞,得到的类胚体称为m EB（Mammo Cult medium-cultured EB）。观察并记录细胞形态变化,确定形成非神经外胚层所需要的时间。第二步,采用3D培养方式,将获得的非神经外胚层接种在Matrigel基质胶上,利用Epi Cult-B完全培养基培养5天后,添加刺激乳腺细胞形成的激素和细胞因子,继续诱导分化,通过观察细胞团形态确定生成类似乳腺结构的细胞团所需要的时间。最后,利用免疫荧光染色检测luminal标志物（CK8/18）和basal标志物（P63）的表达,鉴定分化所得的细胞团中存在乳腺细胞,从而验证诱导方案的可行性。实验结果:1.建立了小鼠诱导多能干细胞株,并通过使用ROCK抑制剂使技术得到优化。利用Y27632抑制ROCK的激酶活性能够促进MEF重编程的速率和效率,提高小鼠诱导多能干细胞扩增培养的存活率和传代效率,并且对Oct4、c-Myc和Nanog等多能性基因的表达也有一定的增强作用,可以促进细胞的干性维持。2.获得了具有小鼠乳腺类器官结构的细胞团。Mammo Cult悬浮培养小鼠诱导多能干细胞10天后产生具有空腔结构的m EB,分化成为非神经外胚层。利用Epi Cult-B进行非神经外胚层的3D培养,13天后形成了具有分枝齿槽状和腺泡状结构的乳腺细胞团,加入氢化可的松、胰岛素、FGF10和FGF2作为诱导剂对乳腺细胞团的获取具有促进作用,产生了表达CK8/18和P63标志蛋白的乳腺细胞,初步实现小鼠乳腺类器官的制备。实验结论:1.利用ROCK抑制剂可以用于优化建立小鼠诱导多能干细胞株的技术。2.利用悬浮培养和3D培养两步诱导方案能够使小鼠诱导多能干细胞向乳腺细胞分化,可以用于小鼠乳腺类器官的模型构建。