氧化应激是肿瘤放化疗中各种药物和射线直接杀伤细胞后的一个重要的继发反应,能够破坏细胞内的氧化-还原稳态,产生大量的活性氧分子(Reactive Oxygen Species,ROS),造成细胞内核酸、蛋白质和脂质等生物大分子的氧化性损伤,最终引起细胞凋亡甚至坏死。氧化性DNA损伤可直接导致基因突变,与肿瘤发生、衰老及炎症等多种病理状态密切相关,而细胞内存在的DNA修复网络可对抗DNA损伤,维持基因组的稳定性。细胞内主要存在7条DNA修复途径,针对氧化性DNA碱基损伤的主要是碱基切除修复(BER),其主要限速酶是脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶APE1。目前研究显示APE1缺陷型细胞对氧化应激极度敏感,提示APE1对ROS引起的细胞凋亡/存活至关重要,但是对于其机制目前仍不清楚。ROS主要由与线粒体DNA(mtDNA)邻近的电子转运链产生,使mtDNA成为ROS的重要靶点,因此mtDNA损伤修复能力对细胞存活/凋亡至关重要。前期研究业已证实DNA修复蛋白APE1可在氧化应激后由胞核转位至线粒体,但是由于APE1缺乏典型的线粒体定位序列,因此其线粒体转位机制仍不清楚。阐明APE1的线粒体转位机制将有助于解析APE1在氧化应激后结构改变与其在各亚细胞组分中功能之间的关系。近年来研究发现APE1缺陷型细胞在氧化应激后线粒体功能显著下降,APE1在转位线粒体后参与mtDNA的修复而阻止了氧化应激引起的线粒体途径的细胞凋亡。从细胞整体来看,APE1是一个主要分布于细胞核的蛋白,具有结构和功能上均密切相关的双功能,但其氧化还原功能是否直接或间接参与了线粒体功能的调控目前尚无报道。因此,对APE1氧化还原功能参与氧化应激后线粒体功能调控机制的研究,将为明确APE1在氧化应激中的调控机制具有重要意义。此外,新近有研究显示,DNA损伤反应(DDR)通路也参与了氧化应激后的细胞命运决定。DDR通路是主要针对DNA双链断裂的信号通路,其主要功能是在细胞受到严重的DNA损伤后协调DNA修复、细胞周期阻滞和细胞凋亡之间关系的信号网络。一般认为DDR并不会在氧化应激早期激活。最新研究显示,DDR重要的上游激酶ATM和DNA-PKcs能在早期被ROS激活,可能参与了氧化应激的细胞调控反应,但其具体机制尚不清楚。因此,本研究所揭示的二者的相互调控机制为DDR通路参与氧化应激后细胞命运决定提供了有力的理论依据。研究目的1.探讨APE1线粒体定位序列、与线粒体转位相关的关键氨基酸残基及氧化应激后可能的线粒体转位机制;2.探讨APE1的氧化还原是否参与线粒体功能调控,通过直接或间接方式调控线粒体相关基因的转录;3.探讨氧化应激早期DNA-PKcs和ATM之间相互调控的分子机制,揭示二者参与氧化应激后细胞命运决定的不同作用;4.利用全基因组表达谱芯片,分析APE1在氧化应激后对基因表达的影响,从整体角度初步探讨APE1在氧化应激中的作用。研究内容和方法1. APE1线粒体定位机制研究:结合前期APE1多肽阵列筛选与线粒体外膜Tom受体蛋白亲和力高的肽段,确定APE1 MTS的可能的分布区域,进一步构建截短型和点突变型APE1载体,通过激光共聚焦和Western blot检测各截短型APE1载体的亚细胞定位,最终确定APE1的MTS及其关键位点。2. APE1氧化还原功能调控氧化应激后线粒体功能的研究:本研究获得意大利Tell教授课题组构建的APE1稳定敲低和突变型HeLa细胞株,主要结果均基于这一细胞系。首先利用JC-1检测APE1缺陷和突变细胞株受到氧化应激后线粒体膜电位的改变,进一步用实时定量RT-PCR方法检测APE1调控线粒体相关基因表达,并用EMSA和ChIP实验验证APE1的氧化还原功能影响线粒体相关核转录因子NRF-1的DNA结合活性和转录活性,最后通过NRF-1瞬时敲低的策略研究APE1调控线粒体膜电位与NRF-1相关性。3. DNA损伤反应通路在调控氧化应激后细胞存活/凋亡中的机制作用:主要研究对象为利用基因打靶技术构建的DNA-PKcs和Ligase4敲除的HCT116细胞及其亲本细胞。首先用H2O2刺激各组细胞,用western blot检测ATM的激活现象,并检测其下游分子通路的磷酸化水平变化,利用DCF探针检测各组细胞ROS产量的差异,并通过流式细胞仪检测细胞凋亡,克隆形成实验验证各组细胞中细胞增殖能力的差异。4.基于表达谱芯片的氧化应激后APE1生物学功能初探:用Illumina公司全基因组表达谱芯片分析APE1缺失型和野生型HeLa细胞在过氧化氢处理或γ射线处理后基因表达的改变,经统计学分析后由Ingenuity公司的IPA分析系统进行生物信息学分析。研究结果1. APE1线粒体定位机制研究:前期Tom蛋白与APE1多肽阵列亲和力研究结果显示APE1可能的MTS区域为:13-39,49-63,211-240,238-258,265-279以及289-312位氨基酸残基。根据这一结果设计APE1截短型载体,并在其C端连接EGFP标签,结果表明,随着N端序列的移除,截短型APE1的细胞内定位逐渐从胞核转变至胞浆,并且当移除大部分N端序列时APE1逐渐特异性的定位于线粒体,当N端288位氨基酸残基全部移除仅剩下289-318位时截短型蛋白定位全部定位至线粒体,说明289-318位氨基酸残基很可能是APE1的MTS。进一步通过点突变载体,发现当K299和R301位氨基酸发生Ala突变后,APE1的线粒体定位丧失,说明二者对APE1的线粒体定位至关重要。最后,通过构建APE1 K299A/R301A全长型突变载体,发现MTS突变后APE1对ROS的敏感性增加,为后期机制研究提供了实验依据。2. APE1氧化还原功能调控氧化应激后线粒体功能的研究:运用流式细胞仪检测JC-1染色发现APE1缺陷型和突变型HeLa细胞在H2O2或Rotenone引起的氧化应激后线粒体膜电位显著下降,膜电位缺失高于野生型HeLa细胞。用实时定量RT-PCR分析显示,线粒体相关的核转录因子NRF-1下游的基因TFAM,COX5b和Tom20的mRNA表达在APE1缺陷型和氧化还原突变型HeLa细胞中显著下调,而EMSA和ChIP实验则显示APE1缺陷或氧化还原突变可显著影响NRF-1的DNA结合活性和转录活性。Co-IP结果显示APE1与NRF-1蛋白具有相互作用。APE1敲低细胞株TFAM下降,而基于敲低细胞株过表达APE1野生型蛋白可恢复TFAM的表达,而用siRNA敲低NRF-1表达后APE1过表达细胞株并无显著TFAM表达的恢复,说明APE1调控线粒体功能是由NRF-1所介导的。3. DNA损伤反应通路在调控氧化应激后细胞存活/凋亡中的机制作用:DNA-PKcs缺陷型细胞ROS刺激后ATM呈现过度磷酸化状态,其下游通路分子磷酸化水平亦上调,但是ATM的过度激活仅与ROS刺激相关,在DSB诱导剂处理后则无此现象,而NHEJ通路另一重要修复酶Ligase4缺陷型细胞则无此现象。利用激光共聚焦显微镜检测γ-H2AX foci在H2O2处理后形成时间晚于ATM激活,表明ATM被ROS激活时独立于DSB的现象。DCF探针染色流式细胞分析显示DNA-PKcs缺陷型细胞中ROS产量显著升高,而Ligase4缺陷型和野生型则无显著变化。流式细胞仪分析细胞凋亡发现DNA-PKcs缺陷型细胞ROS刺激后凋亡较Ligase4和野生型细胞增加,而克隆形成实验显示DNA-PKcs缺陷型细胞氧化应激后增殖能力低于Ligase4缺陷型和野生型细胞。4.基于表达谱芯片的氧化应激后APE1生物学功能初探:基因表达分析显示APE1缺失主要与肿瘤发生及细胞存活/凋亡调控密切相关。过氧化氢处理后,APE1缺失可导致大量基因表达的改变,而γ射线处理后基因表达改变则不明显。结论1.本研究在国际上首次证实APE1 MTS存在于其C端的289-318位氨基酸残基区域,其中K299和R301是APE1的线粒体定位的关键位点,阻断APE1条件性线粒体定位可增强细胞对氧化应激的敏感性;2.首次提出APE1的氧化还原活性对氧化应激后线粒体功能具有显著影响,通过调控NRF-1的DNA结合活性而间接影响其下游与线粒体功能相关的基因表达;3.本研究首次发现DNA-PKcs在氧化应激后可调控ATM的激活及其下游信号通路的活性,并且调控ROS的产量,对氧化应激后的细胞凋亡/存活具有决定性作用。