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目的:阐明吡柔比星(pirarubicin,THP)对骨肉瘤多药耐药细胞系MG63/DOX细胞体外增殖抑制作用及其机制,为耐药骨肉瘤的治疗提供理论依据。
方法:CCK-8法检测阿霉素(doxorubicin,ADM)、THP、顺铂(cisplatin,DDP)、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、吉西他滨(gemcitabin,GEM)对MG63、MG63/DOX细胞的增殖抑制作用。流式细胞仪PI染色法和AnnexinV/PI双染法分别检测细胞周期和凋亡。RT-PCR法检测肿瘤耐药相关基因和细胞周期相关基因mRNA。Western Blotting法检测细胞周期相关蛋白。液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)测定细胞内药物浓度。
结果:MG63/DOX 细胞对ADM、GEM耐药,对THP、DDP、MTX敏感。THP对MG63/DOX细胞的抑制作用呈时间、浓度依赖性。THP与DDP联用能增强对MG63/DOX细胞体外增殖抑制作用。THP将MG63/DOX细胞周期阻滞在G2/M期,且呈时间、浓度依赖性,但对细胞凋亡无明显影响。THP可下调MG63/DOX细胞cyclin B1 mRNA、蛋白及p-Cdc2(Thr161)蛋白表达,上调p-Cdc2(Thr14/ Tyr15)、p-Cdc25C(Ser-216)蛋白表达,但对拓扑异构酶II(Topo Iiα、Topo Iiβ)、ABCB1(MDR1)、Cdc2mRNA 表达及Cdc2、Cdc25C蛋白表达无影响。1000ng/ml THP或ADM作用后,MG63细胞内药物浓度较MG63/DOX细胞显著升高,不同时间点差异均有统计学意义(p<0.01);1000ng/mlTHP作用MG63/DOX细胞或MG63细胞后细胞内药物浓度均较同浓度ADM作用后高,不同时间点差异均有统计学意义(p<0.01)。
结论:(1)THP对MG63和MG63/DOX细胞均有生长抑制作用,与DDP联用能增强对细胞增殖的抑制作用。(2)THP将MG63/DOX细胞周期阻滞在G2/M期,其机制可能与cyclin B1下调以及Cdc2和Cdc25C蛋白磷酸化有关。(3)与ADM相比,THP较易进入MG63、MG63/DOX细胞内,这可能是THP体外抗瘤活性较ADM强的原因之一。