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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于芽胞形成过程中产生的杀虫晶体蛋白,研究杀虫晶体蛋白的结构与功能的关系成为当前的一个热点。Cry1Ac蛋白是目前所知的对鳞翅目昆虫毒性最高蛋白分子之一,在农作物和森林害虫防治、蚊虫控制及水生态系统中害虫防治都具有广泛的应用,但其结构与功能的关系尚未完全明确,需要运用定点突变技术进一步阐释。本论文运用分子生物学理论和生物信息学技术,发现了Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ中独特的β18-β19 loop,通过定点突变技术研究了Cry1Ac5蛋白结构与功能的关系,同时还获得了杀虫活性或稳定性提高的突变子。主要创新的研究内容如下:从高毒力的Bt4.0718菌株中分离克隆了cry1Ac5全长基因,利用穿梭载体pHT315构建了表达载体pHTAc35,电转入无晶体突变株cry-B中,高效表达了130 kDa的Cry1Ac5蛋白,为研究Cry1Ac5蛋白结构与功能提供了前提条件。利用Swiss-Model服务器和Swiss-pdb Viewer软件建立了Cry1Ac5蛋白的三维结构模型,并利用Clustal W和DS ViewerPro软件对比分析了其与其它Cry蛋白之间的差异,发现Cry1Ac5的结构域Ⅲ与其它Cry1蛋白的亲缘关系较远,其结构域Ⅲ上的β18-β19 loop比Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Aa和Cry4Aa蛋白对应的loop长,其组成的残基中色氨酸（W544）、连续的丝氨酸（S547、S548）和loop顶点的天冬酰氨（N546）在Cry蛋白中都是独特的残基分子成分。对β18-β19 loop上的7个残基进行丙氨酸扫描突变,所有突变子（N543A、W544A、G545A、N546A、S547A、S548A、I549A）都能产生菱形晶体和表达130 kDa的蛋白。室内生测表明,突变子N546A对棉铃虫和甜菜夜蛾的致死率有明显提高,而W544A的致死率则显著下降;对Cry1Ac5蛋白分子的三维结构分析表明,N546、S548的侧链伸向蛋白分子表面,可能参与蛋白与其受体分子的相互作用,而W544、G545、S547和I549的侧链伸向蛋白分子内侧,可能与维持蛋白的稳定性有关。对N546进一步突变,获得了突变子N546G、N546D、N546K和删除突变N546Δ及3个双突变和1个三突变,利用等电点沉淀法和AKTApurifier 100系统纯化了毒素蛋白,生测发现N546A(LC50为1.67μg/mL)对棉铃虫毒力比野生型Cry1Ac(LC50为2.98μg/mL)提高了1.78倍,而N546D、N546K和N546Δ的毒力则降低了80～90%。对野生和突变蛋白进行寡聚体形成能力和胰蛋白酶敏感性分析,发现N546不参与寡聚体的形成和维持蛋白的稳定。利用生物素标记蛋白法进行毒素蛋白与昆虫中肠BBMV的竞争和非竞争结合分析,发现N546A的初始结合能力比野生型增强了2倍;N546D初始结合能力与野生型相当,很容易被野生型Cry1Ac竞争;其它N546突变子与BBMV的初始结合能力则明显下降。因此,N546A突变蛋白毒力的强弱与其同昆虫BBMV的结合力强弱一致。进一步对W544突变获得保守的W544F、W544Y和不保守W544C突变子,生测和稳定性分析发现544位残基分子结构有无芳香环不是蛋白功能必须的,但亲水的侧链不利于蛋白的稳定;SDS-PAGE分析发现突变子W544F的原毒素明显的增加了蛋白对紫外线、胰蛋白酶和存贮的稳定性;经原子力显微镜观察,W544F产生的晶体两个顶点间的垂直距离比野生型Cry1Ac长0.6μm;W544F与野生Cry1Ac的杀虫活性相似,但经过紫外照射9 h后,其保留的杀虫活性比野生型高4倍以上,这一结果对解决Cry1Ac毒素蛋白田间应用的问题,具有重要的应用价值。本论文首次发现了Cry1Ac5蛋白结构域Ⅲ上的β18-β19 loop结构的特殊性,并第一次报道了结构域Ⅲ中的loop结构在蛋白功能中发挥的作用,为Cry1Ac的结构域Ⅲ在受体分子的识别和结合、维持蛋白的结构稳定等方面的重要性提供了新的生物学证据。