研究表明，肿瘤的发生及发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，进一步的研究发现，导致此缺陷的原因在于机体对成熟树突状细胞（Dendritic cell，DC）的功能下调。在体外，很多实验证实即使由晚期肿瘤患者外周血分离出的淋巴细胞对多种外界刺激仍然保持着很好的反应能力。因此，通过体外培养DC，诱导特异高效的细胞毒性T淋巴细胞（CTL），回输免疫患者，有望成为治疗肿瘤的绝佳疗法。而目前最需解决的问题是：如何在已知靶抗原的前提下，获得良好活性、足够数量的特异性CTL?DC是人体内功能最强大的抗原递呈细胞。如能将抗原成功加载DC，可诱导抗原特异的CTL。目前，采用粒-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）和白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）已能成功在从外周血单个核细胞培养出DC。但是，在如何有效刺激DC产生CTL的体外操作技术路线上，主要的技术焦点是如何有效地将抗原导入DC?研究表明：不同的抗原加载方式，对DC的活化效率不同，产生CTL的活性也不一致。目前抗原加载存在着多种手段，常用的策略有：抗原肽导入DC及病毒载体携带抗原基因转染DC两种方式。采用肿瘤抗原肽导入DC虽有抗原比较特异，可多次免疫等优点，但存在的主要问题是：这类抗原肽往往半衰期较短，因此需要多次免疫方可获得良好活性的CTL，而且转导效率低下。病毒载体携带抗原肽基因转染DC，可使基因在DC体内稳定表达，从而使DC获得持续而大量的抗原肽刺激，有望解决单纯抗原肽转导存在的问题。目前转染DC常用的病毒载体有：逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）。这三种病毒载体中，AAV较前二种病毒更适用于DC转染。原因有：AAV没有致病性，它是依赖型病毒，如果没有辅助病毒如腺病毒存在，不能完成自主包装：AAV可将携带基因特异整合于人类的第19号染色体上，在保证基因能长期稳定表达的情况下，又不存在逆转录病毒载体的随机整合易诱发癌变的危险，因此具有很高的安全性（到目前为止，还没出现过安全方面的问题）；AAV全长仅为5kb左右，自身免疫原性低，不存在腺病毒具有较高的免疫原性的缺点；AAV转染谱广，既可转染分裂细胞，又可转染非分裂细胞，转染效率高，在我们的前期研究中发现，AAV对DC有很高的转染效率（约为90％），且能上调DC表面标志CD80，CD83，CD86等的表达，从而上调DC的功能；采用AAV为载体，基因转染制备DC诱导CTL时，只需要一次刺激，2周内即可获得良好生物活性的CTL，快速高效（前期的研究成果）；AAV生命力强，运输及贮存均简单易行。在前期研究的基础上，以AAV为载体，设计了以下两部分研究：BA46基因转染DC并诱导CTL治疗乳腺癌：前列腺特异抗原（prostate special antigen, PSA）基因转染DC并诱导CTL治疗前列腺癌；通过这两部分研究，探讨以AAV为载体，将肿瘤抗原基因转染DC，诱导CTL，用于肿瘤治疗的可行性，并在此基础上，优化制备工艺，为临床试用于抗原明确的肿瘤治疗奠定实验室基础。第一部分AAV／BA46转染DC诱导CTL治疗乳腺癌的研究1研究方法：1．1 AAV／BA46病毒制备：从BA46阳性的乳腺癌细胞株Hs 578T抽提总RNA，分离出mRNA。设计引物：5’CCGCAGCATGCCGCGCCC 3’和5’CACTAACAGCCCAGCAGC 3’，RT-PCR扩增，切胶纯化获得BA46 cDNA，测序并比对鉴定后，克隆入腺相关病毒载体AAV（d16-95），构建重组质粒AAV（d16-95）／BA46。无腺病毒参与的pSH3包装系统制备AAV／BA46病毒，纯化，Dot-blot测定病毒滴度。1．2 AAV／BA46转染DC并诱导CTL取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞（DC前体细胞），培养于6孔板，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞（T细胞，冻存备用），取贴壁细胞，将细胞分为基因转染组及对照组，基因转染组感染携带BA46基因的重组腺相关病毒AAV／BA46，感染5h后更换为新鲜AIM-V培养基，对照组以293细胞冻融裂解液刺激，两组细胞均采用重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素4（IL-4）诱导DC成熟。第6天，取原先冻存的T细胞与培养所得的DC按DC：T=1：20比例混合，以AIM-V为培养基，同时加入GM-CSF（800 U／ml）、IL-2（10 U／ml）及IL-7（20 ng／ml），共育7天，诱导获得细胞毒性T淋巴细（CTL）。1．3 AAV／BA46基因表达、整合及DC表面标志检测DC培养第6天，收集悬浮细胞（成熟DC），显微镜观察细胞形态，基因转移组DC经RT-PCR获得BA46 mRNA扩增产物，以³²P-标记的BA46系列探针进行检测。PCR／Southern blot分析AAV／BA46染色体整合情况。流式细胞仪分析DC表面标志，表面标志选择了代表DC特征的：CD80、CD86、CD40等。1．4 DC激活的BA46抗原特异CTL抗肿瘤活性检测激活的CTL细胞表面标志分析：在培养第13天，以带荧光标记的PE-anti-CD4、FITC-anti-CD8和PE-anti-CD56标记CTL，以流式细胞仪检测，从而得出CTL群体中CD8／CD4和CD8／CD56的比值。激活的CTL细胞因子表达分析：在培养第13天，收集CTL，洗涤并以2％的多聚甲醛室温下处理20分钟，以PBS／1％BSA／0.5％皂甙室温下透膜处理10分钟，以带荧光标记的FITC-anti-IFN-r和PE-anti-IL-4标记CTL，以流式细胞仪检测，从而得出细胞内因子IFN-r和IL-4的表达情况。⁵¹Cr释放法检测CTL的杀伤靶细胞的抗原特异性：靶细胞：1、BA46阳性及HLA-Al阳性的人乳腺癌细胞系Hs578T做为一种靶细胞，所有供血者的HLA-Al均与Hs578T是相匹配的。2、以EB病毒感染供血者的淋巴细胞，制备MHC完全相匹配的淋巴细胞系LCL（按说明书的标准方法），并以AAV／BA46反复感染该LCL筛选获得完全同源的BA46阳性LCL（通过流式细胞仪鉴定）做为另一靶细胞。采用6小时⁵¹Cr释放法检测所诱导CTL对各类靶细胞的杀伤效率。⁵¹Cr释放法检测CTL杀伤靶细胞的MHCⅠ类限制性：将各类靶细胞与1／1000 anti-HLAⅠ类抗体预先共育7天，封闭靶细胞的MHCⅠ类抗原后，再以上述的6小时⁵¹Cr释放法检测所诱导CTL对各类靶细胞的杀伤效率。2研究结果：成功构建了AAV／BA46质粒，制备了高滴度的AAV／BA46病毒，AAV／BA46病毒成功转染DC前体细胞（单核细胞），AAV／BA46介导BA46 mRNA成功翻译，AAV／BA46基因成功整合入DC染色体内，DC培养良好，AAV／BA46转染的DC表面标志CD80、CD86明显高表达，仅用1周诱导的CTL中CD8／CD4和CDS／CD56的比值均明显增高，IFN-r表达明显增高，IL-4表达明显减低，而且对BA46阳性的靶细胞有很好的细胞毒杀伤效应，此杀伤具有BA46抗原特异性和MHCⅠ类限制性。3研究结论以AAV为载体介导抗原基因转染DC，并诱导特异的CTL，从技术上是可行的，获得的CTL有较高抗肿瘤活性，有望成为一种肿瘤免疫治疗的理想方法；而且，BA46可能是乳腺浸润性导管癌免疫治疗的理想靶点。第二部分AAV／PSA转染DC诱导CTL治疗前列腺癌的研究1研究方法：1．1 AAV／PSA病毒制备：从PSA阳性的前列腺癌细胞株LNCaP抽提总RNA，分离出mRNA。设计引物：5’-TCGCGCCGAGATGTGGAAT-3’和5’-TGTTCTTCTAGGTCTCCACC-3’, RT-PCR扩增，切胶纯化获得PSA cDNA，测序鉴定与公开的PSA序列吻合后，克隆入腺相关病毒载体AAV（d16-95），构建重组质粒AAV（d16-95）／PSA（简写为AAV／PSA）。无腺病毒参与的pSH3包装系统制备AAV／PSA病毒，纯化，Dot-blot测定病毒滴度。1．2 AAV／PSA转染DC并诱导CTL取健康人外周血，采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞（DC前体细胞），培养于6孔板，贴壁5h，轻轻洗去悬浮细胞（T细胞，冻存备用），取贴壁细胞，以三种不同方法刺激DC前体细胞，包括AAV／PSA转染，PSA蛋白刺激及293细胞冻融裂解物刺激做为对照组，基因转染组感染携带PSA基因的重组腺相关病毒AAV／PSA，感染5h后更换为新鲜AIM-V培养基，PSA蛋白刺激组以脂质体包裹PSA蛋白进行转导，对照组以293细胞裂解物液刺激，各组细胞均采用重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素4（IL-4）诱导DC前体细胞成熟。第6天，取原先冻存的T细胞与培养所得的DC按DC：T为1：20比例混合，以AIM-V为培养基，同时加入GM-CSF（800 U／ml）、IL-2（10 U／ml）及IL-7（20 ng／ml），共育7天，诱导获得细胞毒性T淋巴细（CTL）。1．3 AAV／PSA转染效率分析、基因表达、整合及DC表面标志检测DC培养第6天，收集悬浮细胞（成熟DC），显微镜观察细胞形态，基因转移组DC经过固定及穿透处理后，与鼠anti-PSA单抗共育，然后以FITC标记的羊抗鼠单抗处理后，以流式细胞仪检测AAV／PSA转染效率。同时取标记过的DC细胞，离心后涂片，以荧光显微镜观察，明确PSA多肽在DC细胞内的表达。PCR／Southern blot分析AAV／PSA染色体整合情况。流式细胞仪分析DC表面标志，表面标志选择了代表DC特征的：HLA-DR、CD1a、CD14、CD83、CD80、CD86、CD40等。1．4 DC激活的PSA抗原特异CTL抗肿瘤活性检测激活的CTL细胞表面标志分析：在培养第13天，以带荧光标记的PE-anti-CD4、FITC-anti-CD8、PE-anti-CD56、FITC-anti-CD25、FITC-anti-CD69标记CTL，以流式细胞仪检测，从而得出CTL群体中CD8／CD4和CD8／CD56的比值以及CD25、CD69表达情况。激活的CTL细胞因子表达分析：在培养第13天，收集CTL，洗涤并以2％的多聚甲醛室温下处理20分钟，以PBS／1％BSA／0.5％皂甙室温下透膜处理10分钟，以FITC-anti-IFN-r和PE-anti-IL-4抗体标记CTL，以流式细胞仪检测，从而得出细胞内因子IFN-r和IL-4的表达情况。⁵¹Cr释放法检测CTL的杀瘤活性：靶细胞：1、PSA阳性及HLA-A1阳性的人前列腺癌细胞系LNCaP做为一种靶细胞，所有供血者的HLA-A1均与LNCaP是相匹配的。2、以EB病毒感染供血者的淋巴细胞，制备MHC完全相匹配的淋巴细胞系LCL（按说明书的标准方法），并以AAV／PSA反复感染该LCL筛选获得完全同源的PSA阳性的LCL（通过流式细胞仪鉴定）做为另一靶细胞。同时取多种PSA阴性的其他肿瘤细胞做为阴性对照，采用6小时⁵¹Cr释放法检测所诱导CTL对各类靶细胞的杀伤效率，分析CTL杀伤的抗原特异性，在此基础上，设计不同病毒浓度感染DC诱导获得的CTL，用于对PSA阳性LCL的杀伤，探讨杀伤作用与病毒浓度的相关性。⁵¹Cr释放法检测CTL杀瘤的MHCⅠ类限制性：将各类靶细胞与1／1000anti-HLAⅠ抗体预先共育7天，以MHCⅡ类抗体为阴性对照，分别封闭靶细胞的MHCⅠ类抗原和MHCⅡ类抗原后，再以上述的6小时⁵¹Cr释放法检测所诱导CTL对各类靶细胞的杀伤效率，从而得出CTL杀伤的MHCⅠ类限制性。研究结果：成功构建了AAV／PSA质粒，制备了高滴度的AAV／PSA病毒，AAV／PSA高效转染DC，PSA蛋白在DC内成功表达：AAV／PSA基因成功整合入DC染色体内：AAV／PSA转染的DC表面标志HLA-DR、CD1a、CD83、CD80、CD86、CD40明显高表达；仅用1周即可诱导得到高活性的CTL；AAV／PSA转染所获得CTL的CD8／CD4、CD8／CD56的比值以及CD69、IFN-r的表达均明显高于PSA蛋白剌激组及对照组；而CD25和IL-4的表达低于PSA蛋白刺激组及对照组；而且AAV／PSA转染所获得的CTL对PSA阳性的靶细胞有很好的细胞毒杀伤效应，此杀伤明显优于PSA蛋白刺激组及对照组，而且，该杀伤具有PSA抗原特异性和MHCⅠ类限制性，且与加入的AAV／PSA病毒浓度呈正相关。研究结论本部分研究在第一部分研究的基础上，再一次证实了以AAV为载体介导抗原基因转染DC，并诱导特异的CTL，在技术上是可行的，而且所诱导的CTL活性好于采用抗原蛋白直接转导所得的CTL，有望成为一种肿瘤免疫治疗的理想方法。此研究也说明了以PSA为靶点的免疫治疗可能是前列腺癌一种理想治疗模式。