暗发酵制氢能够将有机废物处理与清洁能源生产耦合,是一种极具应用潜力的生物制氢过程。然而,暗发酵液相产物中还原型产物较多,致使用于质子还原的还原力较少,氢气产率较低。因此,优化产氢菌的代谢途径,将还原力从液相发酵产物引流至氢气合成途径,是目前暗发酵制氢研究的主要方向之一。本文以发酵产物种类较少的Ethanoligenens harbinense（哈尔滨产乙醇杆菌）为发酵菌株,开发基于生物质的添加剂,包括生物炭和银杏叶,用以调整原有代谢产物分布,减少还原型液相产物,进而提高其氢气产率,并对不同添加剂促进发酵制氢的作用机制展开解析。首先探讨了生物炭对E. harbinense发酵产氢的影响,分析了其可能的促进机制及主要影响因素。发酵结果显示,3 g/L生物炭促进效果最佳,E. harbinense的氢气产量和速率分别提高了118.4%和220.3%。对比分析了其它发酵制氢类型,发现生物炭对丁酸型发酵制氢也有明显提升效果,表明其对氢气产率和速率的促进具有普适性。为了探究其促进机制,研究了生物炭对发酵条件和细胞代谢的影响,发现生物炭的碱性能够中和产生的有机酸,延缓发酵液p H下降,提高底物利用率;含氧官能团能释放电子,降低发酵体系的氧化还原电势;生物炭多孔性好,能够吸附细胞;生物炭释放了铁和镁等矿物质元素,有利于产氢菌生长和氢化酶活性。为优化生物炭促进产氢的效果,研究了原材料和热解温度的影响。银杏叶、黄粉虫粪和玉米秸生物炭对发酵制氢有较好的促进效果,而咖啡渣生物炭无促进效果。不同热解温度下银杏叶生物炭理化性质差异较大,其中低温银杏生物炭对氢气产量的促进效果最好,推测可能与银杏叶自身的还原性基团有关。考察了直接投加银杏叶对E. harbinense发酵产物分布和氢气产率的作用。以糖蜜为发酵底物,酸解后糖蜜的氢气产率提高了98.0%。在糖蜜培养基中投加2 g/L银杏叶后,氢气产率提高了21.54%,但发酵延滞期延长。通过适应性驯化解除了银杏叶对产氢菌的抑制,缩短了延滞期。通过响应面设计实验,建立了氢气产率对银杏叶添加量、玉米浆和糖蜜浓度的响应模型,确定了在2.51g/L银杏叶,2.31 g/L玉米浆和10 g/L糖蜜初始糖浓度时,氢气产率最高,达到1.58 mol/mol-己糖。建立了产乙醇杆菌的中心代谢模型,发现添加银杏叶后,流向乙醇合成途径的代谢通量减少,造成NAD（P）H的积累,使得氢气生成途径的通量增加。确定了黄酮是银杏叶促进作用的关键物质,加入0.1 g/L黄酮能将氢气产率提高43.34%,黄酮对产乙醇杆菌发酵产物的影响与银杏叶一致,使还原型液相产物减少,提高了氢气产率。确定了黄酮为银杏叶促进产氢的关键成分后,分析了投加黄酮对E. harbinense转录水平的影响。基于转录组数据,构建了详细的E. harbinense代谢模型;差异表达基因表明,黄酮影响了E. harbinense跨膜运输、糖酵解和乙醇合成等重要途径,在分子层面解释了黄酮对细胞生长的影响和对发酵产氢的促进机制。确定了E. harbinense中5个活跃的氢酶基因,包括1个吸氢酶,1个感应氢化酶,2个铁氧还蛋白依赖型氢化酶,和1个歧化氢化酶。该菌存在3种产氢途径,分别以还原型铁氧还蛋白、NAD（P）H和二者耦合作为电子供体。首次实现了E. harbinense中歧化氢化酶hyd N在酪丁酸梭菌中的表达,使宿主菌生长加快,产氢速率和氢气产量分别提高101.96%和10.57%,首次验证了该歧化氢化酶的功能。发现乙醇生成途径是E. harbinense中产氢途径的主要竞争途径,确定了该途径的关键基因CXQ68＿RS07165和CXQ68＿RS00265,并通过同源重组构建了针对前者的敲除质粒p Dadh E1和p Dadh E2,为构建产氢强化型E. harbinense奠定了基础。