由创伤或退变所致的关节软骨缺损在临床关节外科十分常见,而损伤关节软骨的自身修复能力又很有限,通常导致患者功能障碍、生活质量下降。关节软骨缺损的修复与功能重建是关节外科一大难题,也是近年研究热点之一。目前临床所用修复软骨缺损的主要方法包括“微骨折技术”、“镶嵌成形术”、软骨细胞移植、骨膜和软骨膜移植等。虽然这些方法各有优缺点,但都存在一定缺陷,组织工程技术为关节软骨缺损的再生与修复提供了新的思路和方法。根据支架制备特点的不同,组织工程软骨可分为预制成型软骨和可注射性软骨两类。近年,预制成型软骨修复关节软骨缺损的研究取得了显著进展,其部分产品已成功用于临床,并取得较好疗效,但其临床应用仍存在很大限制。一方面,预制成型软骨需要开放手术将其植入软骨缺损,开放手术可引起关节囊、滑膜和韧带等正常关节结构破坏,增加病人的痛苦,延长康复时间,甚至引起感染、关节僵硬等并发症。另一方面,预制成型软骨制备过程较复杂,在术中塑形及与缺损周围嵌合连接欠佳。可注射性软骨的出现正好弥补了预制成型软骨的上述不足,可注射性软骨可通过微创方式植入,操作简单,创伤小,与缺损周围嵌合连接好,可根据缺损软骨形状任意塑形,特别适合形状不规则软骨缺损的修复,大大提高了临床应用的可操作性,成为组织工程软骨临床应用的发展方向。目前,可注射性软骨的研究尚处于早期阶段,研究内容主要集中于可注射性支架的材料筛选、制备及异位软骨构建等,尚未找到比较理想的种子细胞和可注射性支架,更缺少可注射性软骨原位注射修复关节软骨缺损的相关研究。这一技术从动物实验过渡到临床应用,还有以下几个方面的重要问题需要解决:1.种子细胞的来源;2.可注射性支架的材料选取及制备;3.可注射性软骨原位注射修复关节软骨缺损的可行性。为此,本研究针对以上问题,以猪关节软骨缺损为动物模型,研究了壳聚糖/磷酸甘油可注射性支架对骨髓间充质干细胞生长、增殖和成软骨分化的影响及用作骨髓间充质干细胞的载体体外构建组织工程软骨和体内原位注射修复关节软骨缺损的可行性。首先,通过骨髓穿剌获取骨髓间充质干细胞并行体外扩增培养;把适当比例的壳聚糖溶液与磷酸甘油溶液混和后;将骨髓间充质干细胞加入壳聚糖/磷酸甘油混合液构建壳聚糖/磷酸甘油-细胞凝胶复合物,并在体外三维培养及成软骨诱导分化,观察壳聚糖/磷酸甘油凝胶复合物对骨髓间充质干细胞生长、增殖和成软骨分化的影响及壳聚糖/磷酸甘油-细胞凝胶复合物形成软骨组织能力。结果显示:1、以1×105个细胞/cm2的密度接种的骨髓间充质干细胞,5-6天可长满单层;2、壳聚糖/磷酸甘油凝胶复合物支持骨髓间充质干细胞生长、增殖及成软骨分化;3、壳聚糖/磷酸甘油-骨髓间充质干细胞凝胶复合物在体外培养过程中能保持其初始外形;4、壳聚糖/磷酸甘油-骨髓间充质干细胞凝胶复合物能在体外成软骨培养中形成软骨组织;5、骨髓间充质干细胞可向软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞分化。其次,将壳聚糖/磷酸甘油-骨髓间充质干细胞混合液自体注射入胶原膜覆盖的猪全厚关节软骨缺损处,原位固化构建组织工程软骨以修复软骨缺损,采用大体观察、修复结果分级、组织学、免疫组织化学、GAG定量和磁共振等检测可注射组织工程软骨自体移植修复软骨缺损的可行性。结果显示:1、术后8周和16周,缺损区为透明软骨组织填充,蕃红-O和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性;2、移植区内及移植区周围未发现淋巴细胞浸润,也无血管侵入;3、术后16周组织工程软骨组织GAG含量显著高于对照组,磁共振显示修复区软骨形态和信号正常。综上所述,从本实验可以得出如下结论:1、可注射性壳聚糖/磷酸甘油与骨髓间充质干细胞具有良好的细胞相容性,并支持骨髓间充质干细胞生长、增殖和成软骨分化;2、可注射性壳聚糖/磷酸甘油-骨髓间充质干细胞凝胶复合物在体外成软骨诱导培养条件下,可形成软骨组织;3、可注射性壳聚糖/磷酸甘油凝胶可作为间充质干细胞移植的良好载体;4、可注射性自体髓间充质干细胞-壳聚糖/磷酸甘油凝胶复合物可原位注射修复关节软骨缺损。