【摘 要】
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研究目的肥胖与各种代谢性疾病的发展息息相关,近几十年来已经成为世界范围内公认的亟待解决的公共卫生问题。鸢尾素（irisin）是2012年首次被发现的一种运动诱导产生的激素,是从其前体蛋白纤连蛋白Ⅲ型结构域包含5（FNDC5）水解产生。Irisin的主要功能是通过诱导白色脂肪细胞的棕色化,进而增加全身能量的消耗。因此,irisin在治疗肥胖及相关代谢性疾病方面受到广泛的研究。然而,近年的大量研究表明
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研究目的肥胖与各种代谢性疾病的发展息息相关,近几十年来已经成为世界范围内公认的亟待解决的公共卫生问题。鸢尾素（irisin）是2012年首次被发现的一种运动诱导产生的激素,是从其前体蛋白纤连蛋白Ⅲ型结构域包含5（FNDC5）水解产生。Irisin的主要功能是通过诱导白色脂肪细胞的棕色化,进而增加全身能量的消耗。因此,irisin在治疗肥胖及相关代谢性疾病方面受到广泛的研究。然而,近年的大量研究表明FNDC5在不同的物种中可能存在许多不同的转录本。本课题组之前的研究发现,大鼠INS-1细胞以及各种组织器官中存在一种新的不含跨膜结构域的分泌型FNDC5（secretable FNDC5,sFNDC5）,并且体外及体内实验初步表明此亚型具有抗肥胖的功能。但是,考虑到sFNDC5蛋白共享irisin的大部分序列,对sFNDC5蛋白系统的生物学功能以及与irisin的生物功能比较都需要进一步的探索。本研究中,我们选择了毕赤酵母作为大规模生产高纯度重组分泌型FNDC5（recombinant secretable FNDC5,r-sFNDC5）的有效工具。进一步探讨了 r-sFNDC5 在脂肪细胞能量消耗、褐变和脂肪分解方面的生物活性,并与irisin在脂肪细胞中的生物活性进行了比较。研究方法1.毕赤酵母pPICZαA-sFNDC5质粒的构建与转化。2.r-sFNDC5的表达和纯化。3.r-sFNDC5蛋白的糖基化验证。4.3T3-L1前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化。5.CCK-8法检测细胞活力及r-sFNDC5毒性。6.Western blot 检测 r-sFNDC5 和 r-irisin 处理后 3T3-L1 细胞中 UCP-1、HSL、Perilipin等脂质代谢相关蛋白的表达。7.RT-qPCR检测r-sFNDC5和r-irisin处理后3T3-L1细胞中脂代谢相关mRNA的表达。8.免疫荧光检测UCP-1表达。9.油红染色检测成脂分化。10.r-sFNDC5处理后细胞内ATP检测。11.统计学分析:所有实验均进行生物学重复三次,技术重复两次。结果采用Student’s t检验或单因素方差分析法。P＜0.05被认为差异有统计学意义。研究结果1.sFNDC5基因序列分析通过比对,sFNDC5较irisin缺少跨膜结构域,但共享大部分irisin序列。2.r-sFNDC5在毕赤酵母中的表达与纯化我们利用毕赤酵母表达系统获得了 sFNDC5蛋白,并用Ni-NTA亲和层析柱对其进行了纯化。SDS-PAGE分析显示纯化的r-sFNDC5蛋白分子量在18-27kDa之间。3.r-sFNDC5的糖基化分析去糖基化酶处理后的r-sFNDC5蛋白SDS-PAGE分析显示18kDa左右的单一条带。4.r-sFNDC5对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞褐变和脂肪分解的影响（1）CCK-8检测结果显示,r-sFNDC5（0-100 nM）蛋白对细胞活力无影响。（2）r-sFNDC5蛋白处理分化成熟的3T3-L1脂肪细胞8h后褐变和脂解相关基因表达水平明显上调。（3）经r-sFNDC5处理后,UCP-1和ATGL蛋白表达水平也显著升高。（4）免疫荧光染色进一步证实r-sFNDC5蛋白处理后UCP-1表达水平显著升高。（5）r-sFNDC5蛋白处理后可降低细胞内ATP水平。5.r-sFNDC5抑制3T3-L1细胞成脂分化（1）在3T3-L1细胞成脂分化的整个过程中加入r-sFNDC5蛋白。油红O染色显示r-sFNDC5能够明显减少脂滴的形成。（2）白色脂肪相关基因和蛋白的表达水平也明显降低。6.r-sFNDC5和r-irisin在分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中的功能比较r-sFNDC5和r-irisin处理成熟的3T3-L1脂肪细胞8h,r-sFNDC5处理组在脂代谢相关基因和蛋白水平上都显示优于r-irisin的生物功能。研究结论1.毕赤酵母表达系统表达sFNDC5蛋白,并利用Ni-NTA亲和层析柱对其进行了纯化,可作为大批量生产高纯度重组蛋白的工具。2.r-sFNDC5是一个糖基化蛋白。3.r-sFNDC5具有促进脂肪细胞褐变与脂解的功能。4.r-sFNDC5对脂肪前体细胞的成脂分化具有抑制作用。5.在3T3-L1脂肪细胞脂代谢调节方面,r-sFNDC5的生物活性强于r-irisin。
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