【研究背景和目的】:卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一,因缺乏特异性的症状和有效的早期诊断手段,多数患者确诊时已为晚期,预后差,其死亡率居妇科恶性肿瘤首位。在卵巢原发恶性肿瘤中,60%～90%是卵巢上皮性癌。近年来,虽然在分子生物学方面的研究表明多种基因的表达与基因突变对卵巢癌的发生、发展及预后有着密切的关系,但其发病机制还不十分明确。因此,研究卵巢上皮性癌的发病机制,寻找影响卵巢癌发生、发展的分子生物学靶点,对于卵巢癌的靶向治疗具有重要意义。CHP2(Calcineurin B homologous protein 2)是最近从肝癌患者cDNA文库中筛选出来的一个新的肿瘤相关抗原,可表达于某些肿瘤如肝癌、结肠癌、卵巢癌等,而相应的正常组织或细胞中没有检测到表达,其生物学功能目前尚不明确。我们以往的研究证明CHP2能够增加卵巢癌细胞OVCAR3的增殖能力、粘附能力、运动能力和侵袭能力,说明CHP2表达促进了卵巢癌细胞OVCAR3的恶性行为。为了进一步研究卵巢癌细胞内pH值的调节机制,本研究旨在探讨血清饥饿条件下,肿瘤相关抗原CHP2在卵巢癌细胞中通过调节NHE1的活性来改变卵巢癌细胞内pH值及其对卵巢癌细胞生长抑制的影响。【方法】:1、CHP2在卵巢癌细胞株中的表达:RT-PCR法测定各细胞株的CHP2mRNA的表达,选定目标细胞株。2、质粒提取与转染:提取pEGFP-N1-CHP2表达载体,并通过脂质体介导的基因转染方法,将此质粒转染入3AO细胞中,并筛选出稳定克隆。实验分为3组,CHP2基因转染组(3AO/CHP2组)、空载体转染组(3AO/Neo组)和空白对照组(3AO组)。3、CHP2和Na~+/H~+exchanger isoform 1(NHE1)在3AO细胞中表达的鉴定:利用RT-PCR技术检测3组细胞中CHP2和NHE1转录水平的表达。用荧光显微镜观察的方法检测3组细胞中CHP2绿色荧光融合蛋白水平的表达。4、细胞内pH值的测定:应用“K~+/nigericin pHi clamp”方法,测定3组细胞在无血清RPMI 1640中培养8h、10h、12h后的细胞内pH值。5、细胞生长及存活实验:将处于对数生长期的3AO/CHP2、3AO/Neo和3AO以相同数量分别接种在含10%新生牛血清及无血清的RPMI 1640中,应用细胞活力仪对活细胞进行计数绘制生长及存活曲线。6、统计学方法:实验中所测数据以(?)±s表示,组间差异利用单因素方差分析配合Neuman-Keuls检验进行比较,统计分析使用SPSS13.0软件包,P＜0.05被认为有统计学意义。【结果】:1、CHP2在各卵巢癌细胞株中的表达:上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、A2780中CHP2 mRNA阳性表达;上皮性卵巢癌细胞株3AO CHP2阴性表达。故选取细胞株3AO进行本次试验。2、质粒提取与转染:使用无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化重组质粒pEGFP-N1-CHP2,可见紫外分光光度计检测质粒的纯度和含量均达到转染要求。并成功筛选出稳定表达CHP2的细胞株3AO/CHP2。3、CHP2和NHE1在3AO细胞中表达的鉴定:在未转染和空载体转染的3AO细胞中没有检测到CHP2的表达,在pEGFP-N1-CHP2表达载体转染后3AO细胞中有CHP2的高表达。在3组3AO细胞中均有NHE1的强表达,而且在转染前后没有改变。荧光显微镜下观察发现EGFP/CHP2融合蛋白主要表达于胞浆近膜区,而在空载体转染组EGFP则广泛表达于整个细胞。4、细胞内pH值的测定:应用“K~+/nigericin pHi clamp”方法及直线回归法求得细胞pHi与荧光强度比值(FIR=530 nm/640 nm)间的相关系数及直线回归方程:Y=5.6927+0.2369X。各组细胞内530 nm/640 nm的荧光强度比值(FIR)与pHi测定结果显示:在无血清RPMI 1640的培养下,3AO/CHP2转染组细胞随着时间的增加,胞内FIR减少不明显,pHi降低也不明显;而3AO/Neo、3AO细胞随着时间的增加,胞内FIR明显减少,pHi明显降低,具有统计学意义(P＜0.05)。5、细胞生长及存活实验:在10%血清的RPMI 1640的培养下,3AO/CHP2转染组细胞的生长速度较3AO/Neo和3AO组增快(P＜0.05);在无血清RPMI 1640的培养下,3AO/CHP2转染组细胞在各个时间点的死亡细胞数量较3AO/Neo和3AO两组明显减少(P＜0.05)。【结论】:本研究首次证实了在血清饥饿条件下,肿瘤相关抗原CHP2是卵巢癌细胞NHE1的生理活性的调节亚单位,是维持卵巢癌细胞内pH值不可缺少的辅助因子,从而减少血清饥饿状态下卵巢癌细胞的死亡。因此,降低卵巢恶性肿瘤细胞中CHP2表达或抑制其活性可望成为CHP2表达阳性肿瘤的生物学治疗的新方法和手段。