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背景:一氧化氮(nitric oxide, NO)是一种具有多种生物学活性的新型生物信息分子,调节多种生理病理反应,并参与银屑病、红斑狼疮、变态反应性疾病及某些皮肤肿瘤的致病过程。皮肤组织中多种细胞能合成NO,其合成分泌受多种因素调节。但NO在皮肤细胞炎症反应、增殖与凋亡方面的作用仍不很明确。复方甘草酸苷(Compound Glycyrrhizin, CG)是从中药甘草根部提取,以甘草酸苷为主要成分,具有抗炎、抗过敏、免疫调节、类激素样等药理作用。在银屑病、变态反应性皮肤病的治疗中取得较好疗效,但其作用机制尚不清楚。目的:本研究旨在研究一氧化氮(NO)对正常皮肤炎症反应的作用,对正常及紫外线照射后人表皮细胞凋亡的影响。同时研究复方甘草酸苷对培养的人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)增殖凋亡的作用,及复方甘草酸苷对HaCaT细胞合成分泌NO、iNOS表达的影响。以探讨复方甘草酸苷调节HaCaT细胞增殖、凋亡作用的机制,为复方甘草酸苷用于皮肤病治疗提供实验依据。方法:(1)NO对皮肤的致炎症作用:于12例健康人皮肤外用5%亚硝酸盐及不同浓度沸石一氧化氮霜,通过真皮血流变化曲线确定与5%亚硝酸盐产生相近NO生理效应的沸石一氧化氮霜的浓度,并通过化学发光法比较二者真皮浅层NO含量。将5%亚硝酸盐、33%沸石一氧化氮、33%沸石及2%抗坏血酸霜外用于正常皮肤48小时后,应用组织切片HE染色及CD3、CD4、CD8、CD68、CD1a及中性粒细胞弹性蛋白酶免疫组化染色观察表皮及真皮炎症反应,镜下计数阳性反应细胞数,应用ELISA法测定二者外用后表皮负压吸引疱疱液中IL-4及IFN-γ水平。(2)NO对紫外线(UV)诱导表皮细胞凋亡的作用:测定12例志愿者311nm中波紫外线(UVB)照射后最小红斑量(MED),以2倍MED的UVB照射右前臂屈侧皮肤,于照射及非照射部位均外用33%沸石一氧化氮霜及空白对照剂,24小时后取皮肤活检,应用组织切片HE染色和Caspase3、p53免疫组化染色检测表皮细胞凋亡,比较各组凋亡细胞数。(3)细胞学研究:将不同浓度的CG作用于体外培养的HaCaT细胞,在24、48及72小时采用CCK8法检测CG对HaCaT细胞体外增殖的影响,硝酸还原酶法检测HaCaT细胞分泌的NO含量,根据CCK8结果用流式细胞仪测定CG作用后48小时细胞凋亡率,逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测48小时HaCaT细胞诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)mRNA的表达,分析其相对表达量,Western免疫印迹检测HaCaT细胞iNOS蛋白表达水平。结果:①二种NO供体外用于皮肤后,33%沸石一氧化氮霜与5%亚硝酸盐霜血流曲线相近,前者真皮浅层NO水平略高于后者,二者比较无明显差异(P>0.05)。②炎症细胞结果:二者外用于皮肤后,33%亚硝酸盐组表皮CD68+细胞较正常对照明显增多(P<0.05),真皮CD3+、CD4+、CD68+及中性粒细胞弹性蛋白酶阳性细胞较正常对照明显升高(P<0.05)。而外用33%沸石一氧化氮霜组真皮中CD4+细胞明显增高(P<0.01),其他炎症细胞与正常对照组比较无统计学差别(P>0.05)。③ELISA法测定外用33%沸石一氧化氮霜后表皮负压吸引疱疱液中IFN-γ水平较正常对照显著增高,IL-4水平未测出。④细胞凋亡结果:2倍MED紫外线照射后表皮细胞凋亡明显增加(P<0.01),外用NO供体诱导表皮细胞凋亡不明显(P>0.05)。紫外线照射后24小时,外用NO供体处凋亡的表皮细胞较外用对照剂处明显减少(P<0.05)。⑤CCK8及流式细胞仪检测结果:不同浓度的CG对HaCaT细胞的作用不同。低浓度CG促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,100ug/ml时增殖率最高、凋亡率最低,较对照组有显著差异;中高浓度CG促HaCaT细胞增殖作用减弱,促凋亡作用增强,1000ug/ml时明显抑制HaCaT细胞增殖,上述作用48小时即明显。⑥NO水平:不同浓度CG在各时间点对HaCaT细胞分泌NO的浓度呈现出双向调节趋势,低浓度促进NO分泌,高浓度抑制NO分泌。24小时CG浓度为20μg /ml时NO水平达高峰(708.3±17.7μg /ml),较对照组显著增高(P<0.05),48及72小时CG浓度40μg /ml时NO分泌达高峰,但与未加药组比均无显著差异。⑦RT-PCR及Western免疫印迹结果:CG作用48小时在低浓度时促进HaCaT细胞iNOSmRNA及iNOS蛋白表达,高浓度时抑制表达,均表现浓度依赖性,100ug/ml时表达最强,1000ug/ml时表达最低,较对照组均有显著性差异(P<0.05)。结论:①3 3%沸石亚硝基化霜与5%亚硝酸盐霜外用于正常人皮肤可产生相近的生理学效应。②5%亚硝酸盐霜外用引起表皮及真皮明显炎症反应,33%沸石一氧化氮霜对表皮无明显致炎症作用,仅可引起真皮内CD4+T淋巴细胞浸润,以Th1细胞浸润为主。③2倍MED的UVB照射可显著诱发正常人表皮细胞凋亡,NO对正常人表皮细胞无明显致凋亡作用,对UVB照射诱发的表皮细胞凋亡有明显抑制作用。④复方甘草酸苷对HaCat细胞增殖凋亡的影响随浓度变化不同,低浓度时促进细胞增殖,抑制凋亡;高浓度时抑制增殖,促进凋亡。可能与CG调节HaCaT细胞iNOS表达有关。