【摘 要】
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在神经信号传导的过程中V-ATP酶不仅为突触囊泡中神经递质的合成、分泌、摄取和再储存提供动能,同时还参与囊泡中神经递质的释放。杠柳新苷T（PST）是从植物杠柳（Periploca sepium Bunge）根皮中分离得到的具有较高杀虫活性的杠柳新苷类化合物,前期研究发现PST可浓度依赖性抑制东方黏虫（Mythimna Separata）幼虫中肠刷状缘膜囊泡（BBMV）中的V-ATP酶活性。基于此,
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“杠柳毒素作用昆虫中肠V-ATP酶A亚基的结合位点及其成药性研究”基金（编号:31972303）；
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在神经信号传导的过程中V-ATP酶不仅为突触囊泡中神经递质的合成、分泌、摄取和再储存提供动能,同时还参与囊泡中神经递质的释放。杠柳新苷T（PST）是从植物杠柳（Periploca sepium Bunge）根皮中分离得到的具有较高杀虫活性的杠柳新苷类化合物,前期研究发现PST可浓度依赖性抑制东方黏虫（Mythimna Separata）幼虫中肠刷状缘膜囊泡（BBMV）中的V-ATP酶活性。基于此,本研究以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）幼虫为供试昆虫,PST为供试药剂,对四种来源相同但神经系统基因背景不同的黑腹果蝇幼虫w1118（野生型品系,源自Oregon-R）、parats1（源自Oregon-R品系钠通道I265N点突变所产生的抗菊酯类杀虫剂突变品系）、parats1;DSC1-/-(parats1品系敲除DSC1通道的突变品系)和DSC1-/-(w1118敲除DSC1通道的突变品系)的毒力和行为学特性进行了研究。并运用细胞内微电极技术比较了PST对四种果蝇品系幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路电位活动的影响,明确杠柳新苷类化合物是否通过作用于突触V-ATP酶影响神经回路的兴奋性传导,旨在阐明其杀虫作用机理。论文主要结果如下:1.毒力测定表明,四种果蝇品系幼虫对PST的敏感性从高到低依次为:parats1、w1118、parats1;DSC1-/-、DSC1-/-。敲除DSC1通道的DSC1-/-品系对PST的敏感性最低,与w1118有显著性差异,其LC50是w1118的1.66倍;parats1品系与parats1;DSC1-/-品系相比,敲除DSC1通道后幼虫对PST的敏感性降低。行为学测定表明,四种果蝇品系在正常状态下对机械触觉刺激的反应、体壁运动能力无显著性差异,但嘴钩运动能力有显著性差异,这说明神经系统基因背景的差异对行为产生的影响不同。饲喂500 mg/L的PST 48 h后,对机械刺激的敏感性降低,但饲喂前后没有显著性差异;体壁运动和嘴钩运动能力显著降低,未敲除DSC1通道的w1118和parats1品系幼虫的运动能力降低幅度显著大于敲除DSC1通道的parats1;DSC1-/-和DSC1-/-品系。2.对四种果蝇品系幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路电位活动的测定表明,正常状态下未敲除DSC1通道的w1118和parats1品系的EJP频率显著低于敲除DSC1通道的parats1;DSC1-/-和DSC1-/-品系;在记录的20 min内,四种果蝇品系兴奋性衰减趋势无明显差异,但敲除DSC1通道的两种品系与未敲除的两种品系相比衰减趋势较为缓慢,这表明正常状态下DSC1通道在幼虫神经回路活动中通过起负向调节的作用来维持神经系统的稳定性。3.用4μM PST处理果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路离体标本,PST加快了神经回路EJP频率的衰减,抑制了果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路兴奋性的传导,四种果蝇品系被抑制程度无显著性差异。2μM BA1处理幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路离体标本,BA1也加快了神经回路EJP频率的衰减,抑制了果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路兴奋性的传递,四种果蝇品系被抑制程度也无显著性差异。经PST处理后的感觉-中枢神经系统-运动回路EJP频率下降趋势与BA1处理基本一致,这表明PST和BA1作用类似,都是通过抑制V-ATP酶的活性抑制果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路兴奋性的传导。4.幼虫离体标本感觉-中枢神经系统-运动回路经PST和BA1处理后,四种果蝇品系神经系统兴奋性传递被抑制的幅度无显著性差异但敲除DSC1通道的两种品系EJP频率下降幅度较小,这个结果与毒力测定和行为学测定结果一致,即敲除DSC1通道后,果蝇幼虫对PST和BA1的敏感性降低。推测在逆境条件下DSC1通道为维持神经回路稳定性可能发挥正向调节作用,增强了兴奋性传导,但PST或BA1在神经回路中主要通过作用于突触前膜V-ATP酶抑制兴奋性传导,因此敲除DSC1通道的果蝇品系幼虫由于缺乏这一调节机制,导致对PST和BA1的敏感性降低,表现出EJP频率下降幅度较小。上述结果从神经电生理的角度进一步证实了PST和BA1一样通过抑制V-ATP酶的活性抑制果蝇幼虫感觉-中枢神经系统-运动回路的兴奋性传导,四种品系果蝇幼虫对PST敏感性的差异可能与DSC1通道在调节神经系统稳定性方面的作用有关,是神经系统遗传背景的差异所致。
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